免疫共沉澱（Co-IP）試劑準備

免疫共沉澱（Co-IP）試劑準備

 1.  預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好後，埋冰下），離心機。

 2.  用預冷的PBS洗滌細胞兩(liang) 次，最後一次吸幹PBS。

3.  加入預冷的RIPA Buffer(1 ml/107個(ge) 細胞、10 cm培養(yang) 皿或150 cm2培養(yang) 瓶，0.5 ml/5x106個(ge) 細胞、6 cm培養(yang) 皿、75 cm2培養(yang) 瓶）。

 4.  用預冷的細胞刮子將細胞從(cong) 培養(yang) 皿或培養(yang) 瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。

 5.  4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉移到一個(ge) 新的離心管中。

 6.  準備Protein A agarose，用PBS 洗兩(liang) 遍珠子，然後用PBS配製成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

 7.   每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

 8.   4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉移到一個(ge) 新的離心管中，去除Protein A珠子。

 9． （Bradford 法）做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝後，可以在-20℃保存一個(ge) 月）。

 10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興(xing) 趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 ug/ul）。

 11.  加入一定體(ti) 積的兔抗到500 ul總蛋白中，抗體(ti) 的稀釋比例因興(xing) 趣蛋白在不同細胞係中的多少而異。

 12.  4℃緩慢搖動抗原抗體(ti) 混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。

 13.  加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體(ti) 複合物，4℃緩慢搖動抗原抗體(ti) 混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體(ti) 為(wei) 鼠抗或雞抗，建議加2 ul "過渡抗體(ti) "（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。

 14.  14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體(ti) 複合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有時候會(hui) 破壞瓊脂糖珠-抗原抗體(ti) 複合物內(nei) 部的結合，可以使用PBS。

 15.  用60 ul 2x上樣緩衝(chong) 液將瓊脂糖珠-抗原抗體(ti) 複合物懸起，輕輕混勻，緩衝(chong) 液的量依據上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）。

16.  將上樣樣品煮5 min，以遊離抗原，抗體(ti) ，珠子，離心，將上清電泳，收集剩餘(yu) 瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以後電泳，電泳前應再次煮5 min變性。