免疫組化常見問題分析

免疫組化常見問題分析

1.脫片產(chan) 生的原因有哪些

  1、烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

  2、多聚賴氨酸玻片質量的問題。

  3、組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

  4、修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複液時手法不好，咚的一聲就丟(diu) 進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，隻有從(cong) 另外的問題上著手。

  5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從(cong) 邊緣上慢慢吸水。

  6.組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。

2.邊緣效應

1、組織邊緣與(yu) 玻片粘貼不牢，邊緣組織鬆脫漂浮在液體(ti) 中，每次清洗不易將組織下麵試劑洗盡所致. 解決(jue) 辦法：製備優(you) 質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚於(yu) 4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織；

2、切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高而致染色深。解決(jue) 辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為(wei) 了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

3.切片染色後背景太深，如何區分特異性sing與(yu) 非特異性著色

全片著色是指整個(ge) 切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

（1）抗體(ti) 濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決(jue) 辦法是，每次使用新抗體(ti) 前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體(ti) 個(ge) 體(ti) 化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體(ti) 也應如此，不能隻簡單的按說明書(shu) 進行染色。

（2）抗體(ti) 孵育時間過長或溫度較高：解決(jue) 辦法是，嚴(yan) 格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳(chuan) 統的1小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長，因為(wei) 在沒有酶的情況下，過氧化氫也會(hui) 遊離出氧原子與(yu) DAB產(chan) 生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體(ti) 顯色時進行監控，避免顯色時間過長。

（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體(ti) 、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決(jue) 的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體(ti) 流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩衝(chong) 液或修複液中浸泡時間太長（大於(yu) 24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第二天加抗體(ti) 進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修複液的容器放在4ºC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(hui) 出現背景著色，因此，不可存放時間太長。

（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體(ti) ：注意抗體(ti) 的有效期，過期的抗體(ti) 要麽(me) 不顯色要麽(me) 背景著色。用新買(mai) 的抗體(ti) 時最好設立陽性對照和用使用過的抗體(ti) 作比較。

4.免疫組化染色呈陰性結果

1、抗體(ti) 濃度和質量問題以及抗體(ti) 來源選擇錯誤；

2、抗原修複不全，對於(yu) 甲醛固定的組織必須用充分抗原修複來打開抗原表位，以利於(yu) 與(yu) 抗體(ti) 結合；建議微波修複用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修複；

3、組織切片本身這種抗原含量低；

4、血清封閉時間過長；

5、DAB孵育時間過短；

6、細胞通透不全，抗體(ti) 未能充分進入胞內(nei) 參與(yu) 反應；

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(ge) 陽性對照片，排除抗體(ti) 等外的方法問題。

5.背景

1、考慮一抗濃度高；

2、然後調整DAB孵育時間；

3、也要考慮血清封閉時間是否過短；

4、適當增加抗體(ti) 孵育後的浸洗次數和延長浸洗時間等。