雙鏈DNA探針的合成方法

實驗原理

     分子生物研究中，zui常用的探針即為(wei) 雙鏈DNA探針，它廣泛應用於(yu) 轉基因植物拷貝數的鑒定、臨(lin) 床診斷等方麵。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩(liang) 種:切口平移法和隨機引物合成法。hth体育下载地址

    切口平移法（nick translation） 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chan) 生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3＇羥基末端。同時該酶具有從(cong) 5＇→3＇的核酸外切酶活性,能從(cong) 切口的5＇端除去核苷酸。由於(yu) 在切去核苷酸的同時又在切口的3＇端補上核苷酸,從(cong) 而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。zui合適的切口平移片段一般為(wei) 50-500個(ge) 核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: （a） 產(chan) 物的比活性取決(jue) 於(yu) [α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。（b） DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質量會(hui) 影響產(chan) 物片段的大小。（c） DNA模板中的抑製物如瓊脂糖會(hui) 抑製酶的活性, 故應使用仔細純化後的DNA。

實驗試劑

（） 0×切口平移緩衝(chong) 液:  0.5M/L Tris-Cl （pH7.2）；  0.M/L MgSO4； 0mM/L DTT；  00ug/ml BSA。

（2） 未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其餘(yu) 3種分別溶解於(yu) 50mM/L Tris·Cl （pH7.5）溶液中,濃度為(wei) 0.3mM/L。hth体育下载地址

（3） [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 0uCi/ul。

（4）E.coli DNA聚合酶Ⅰ：（4單位/ul）：溶於(yu) 50ug/ml BSA, mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl（pH7.5）中。

（5） DNA酶:mg/ml。

（6） EDTA :200mM/L （pH8.0）。

（7） 0M/L NH4Ac。

實驗步驟

（） 按下列配比混合:未標記的dNTP 0ul   0×切口平移緩衝(chong) 液 5ul    待標記的DNA ug

[α-32 P]dCTP或dATP（70uCi） 7ul    E.coli DNA聚合酶 4單位    DAN酶 I ul

加水至終體(ti) 積 50ul

 （2） 置於(yu) 5℃水浴60分鍾。

 （3） 加入5ul EDTA終止反應。

 （4） 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為(wei) 0.5M/L, 加入兩(liang) 倍體(ti) 積預冷無水乙醇沉澱回收DNA探針。

注意事項

、3H，32P及35S標記的dNTP都可使用於(yu) 探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。

2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。hth体育下载地址