細胞培養基製備原材料需要及裂解液的製備

細胞培養(yang) 基製備原材料需要及裂解液的製備

    細胞培養(yang) 基的製備工作涉及物理、化學和生物等各方麵知識，但基本原理不外乎兩(liang) 方麵。一是得用混合物中幾個(ge) 組分分配率的差別，把它們(men) 分配到可用機械方法分離的兩(liang) 個(ge) 或幾個(ge) 物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於(yu) 單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於(yu) 來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪(sang) 失。細胞培養(yang) 基的製備一般分為(wei) 以下四個(ge) 階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、幹燥和保存。

　　微生物、植物和動物都可做為(wei) 製備細胞培養(yang) 基的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於(yu) 微生物，應注意它的生，在微生物的對數生，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chan) 量，以微生物為(wei) 材料時有兩(liang) 種情況：（）得用微生物菌體(ti) 分泌到培養(yang) 基中的代謝產(chan) 物和胞外酶等；（2）利用菌體(ti) 含有的生化物質，如細胞培養(yang) 基、核酸和胞內(nei) 酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與(yu) 季節性關(guan) 係密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐(feng) 富的髒器組織為(wei) 原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於(yu) 易分解的生物大分子應選用新鮮材料製備。

裂解液的製備步驟：

    、將長滿細胞的培養(yang) 基瓶放置在冰上，用吸液管吸出培養(yang) 液。加入足夠的冷的PBS在培養(yang) 瓶中充分洗滌細胞表麵，以洗去瓶中殘留的培養(yang) 基，倒掉PBS ，重複以上操作2-3遍。在zui後一次洗滌中盡可能吸幹殘留的PBS，盡量在冰上操作。

　　2、向培養(yang) 瓶中加入冷的RIPA 裂解緩衝(chong) 液(每75cm2 培養(yang) 瓶加ml). 然後用細胞刮子沿著瓶壁開始刮細胞，如果所需要刮的同種細胞有多瓶，則將*瓶刮下的細胞液吸出轉入下一瓶中繼續刮(由於(yu) 處理後的細胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點的吸液管吸取)。

　　3、吸出刮好的細胞裂解液置於(yu) 4ml 離心管中（置於(yu) 冰上），然後重複步驟2以刮取剩下的細胞。

　　4、盡可能將多的細胞培養(yang) 基裂解液收集到4ml的離心管中，樣品插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產(chan) 生泡沫為(wei) 準，超聲每次2-3秒，重複3-4次。如仍有細胞碎片或沉澱，應離心0000rpm,0分鍾，留取上清。

　　5、取出小量細胞裂解液測其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計，在A280測定），分裝保存在-70℃。