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 HRP是一種分子量達44 000的糖蛋白，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合而成，中性糖和氨基糖約占8％，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一個(ge) HRP分子中含一個(ge) 氯化血紅素IX作輔基，該輔基在403nm波長處有zui大吸收峰，而去輔基的酶蛋白在275nm波長處有zui大吸收。HRP在403nm的OD值與(yu) 275nm的OD值之比，也就是所謂的RZ（Reinheits Zahl）值。RZ值僅(jin) 說明血紅素基團在HRP中的含量，並非表示HRP製劑的真正純度，而且RZ值高的HRP製劑，並不意味著酶活性也高。但可以一純酶溶液在0mm光徑403nm波長下的吸光度來計算酶濃度[％（W/V）酶溶液吸光度為(wei) 22.5，濃度為(wei) 227umol/L]。純HRP幹燥貯存於(yu) –20oC可保持穩定，使用.36 mol/L甘油、0mmol/L磷酸鈉、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L（pH 7.4）溶液作為(wei) 基質冷凍保存，可使酶結合物穩定數年。HRP對熱及有機溶劑的作用比較穩定，用甲苯與(yu) 石蠟切片處理或用純乙醇或l0％甲醛水溶液固定做冷凍切片，均不能使其活性改變。硫化物在0–5～0–6mol/L濃度時具有可逆性地抑製HRP的作用；氟化物、疊氮化合物或羥胺僅(jin) 在高於(yu) 0-3mol／L濃度時抑製HRP；HRP還可被羥甲基過氧化氫不可逆地抑製。強酸也是HRP的強烈的抑製劑。因此，在酶免疫測定常選用上述的某些化合物如氟化鈉、疊氮鈉和強酸等作為(wei) 酶反應的終止劑。此外，在配製酶免疫測定的稀釋緩衝(chong) 液時，為(wei) 防止酶失活，應避免使用疊氮鈉作防腐劑。HRP的同工酶主要可分為(wei) 三種類型：①含糖量高的酸性同工酶。②等電點接近於(yu) 中性（或微堿）的含糖量相對較低的同工酶。③含糖量低的堿性（PI>）同工酶。酶免疫試驗中所使用的HRP，以PI為(wei) 8.7～9.0的所謂“C”同工酶為(wei) 主要組成成分，其他同工酶的活性則很低。“C”同工酶的共價(jia) 結構由2個(ge) 密切接近的區域組成，血紅素基團則位於(yu) 其間而成夾心結構，糖鏈以8個(ge) 不同的部位結合於(yu) 多肽。天然的酶所帶的純電荷極少；無遊離的。—氨基，僅(jin) 有2個(ge) 可測出的，6個(ge) 賴氨酸似乎全被糖鏈外殼所遮蓋。因此，HRP一般僅(jin) 有～2個(ge) 可用於(yu) 耦聯的氨基。

根據HRP的催化特性，ELISA中一般使用過氧化氫（H2O2）作為(wei) HRP底物之一，在供氫體(ti) （即色原底物）存在時，HRP與(yu) H2O2的反應迅速而又專(zhuan) 一。由圖4可見，HRP被H2O2二價(jia) 地氧化形成複合物I，而複合物I又可與(yu) 氫供體(ti) 的二步連續的單價(jia) 相互作用而還原至起始狀態。複合物Ⅱ是被氧化的帶一個(ge) 電子的中間產(chan) 物，當H2O2過量，由於(yu) 複合物Ⅲ或Ⅳ的形成，酶活性受抑製（以後補上）。

30％的H2O2並不穩定。由於(yu) H2O2既為(wei) HRP的底物，也為(wei) 其抑製劑，因而ELISA要想得到滿意的測定結果，H2O2必須限定在一定的濃度範圍內(nei) ，終濃度通常為(wei) 2～6 mmol/L。然而在實際研究工作中，一般很少注意這一點。大多數研究者所使用的H2O2的濃度常較理想反應所需的量大2～4倍。吸附於(yu) 固相的HRP較遊離的HRP更易受過量H2O2的抑製。如果30％H2O2貯存液濃度經測定證實確為(wei) 30％，則稀釋0 000—2 000倍常是較為(wei) 理想的底物。H2O2的摩爾消光係數為(wei) 0mm光徑240nm波長下為(wei) 43.6，因此，可通過這種方式來檢測H2O2工作溶液的濃度。

固相ELISA中，當溫度高於(yu) 20oC時，HRP活性常較低，在底物溶液中加入非離子去垢劑聚-20或TritonX-00可延遲HRP的失活，且可使反應溫度加大，但非離子去垢劑的這種酶活性保護效應依氫供體(ti) 的不同而有差異。如以2,2’-聯氮-雙-[3-乙基苯並噻唑啉]-6-磺酸（ABTS）為(wei) 氫供體(ti) ，則隻能保護20％的酶活性，而以鄰聯茴香胺（ODA）為(wei) 氫供體(ti) 時，酶活性的保護提高至90％。

HRP之所以是迄今為(wei) 止在ELISA中應用的標記用酶，主要是因為(wei) 其一方麵易於(yu) 提取，價(jia) 格相對低廉；另一方麵性質穩定，耐熱及有機溶劑的作用，與(yu) 抗原或抗體(ti) 偶聯後，活性很少受損失。