揭示蛋黃抗體的研究結果

揭示蛋黃抗體(ti) 的研究結果

    高免蛋黃抗體(ti) 具有生產(chan) 過程簡單、效率高等特點，已越來越多地應用於(yu) 人類許多疾病的預防和治療以及生物學的高度特異性檢測等領域中，並取得顯著成效。本文主要研究了以人致病性大腸杆菌為(wei) 抗原，免疫母雞，研究獲得含有價(jia) 蛋黃抗體(ti) 的雞蛋的*條件；建立快速、準確、定量的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定蛋黃抗體(ti) （IgY）效價(jia) 的技術；研究抗人大腸杆菌IgY分離純化條件及其理化、生化特性；研究食品加工過程中的各種因素對大腸杆菌特異IgY生物活性的影響；探討抗人大腸杆菌免疫雞蛋抗體(ti) 的功能及其機理；評估蛋黃抗體(ti) 的安全性。

主要獲得如下結果：

    （） 對獲得含有價(jia) 蛋黃抗體(ti) 的雞蛋的*條件研究發現：（a） 以大腸杆菌懸浮液對20周齡京白蛋雞免疫時，若固定免疫抗原劑量為(wei) 0.5ml，則當菌液濃度低於(yu) ×0~9 cfu／ml，免疫應答強度隨免疫劑量的降低而降低，當菌液濃度高於(yu) ×0~9 cfu／ml時，免疫應答強度不會(hui) 隨免疫劑量的增加而得到明顯加強。因此，確定*免疫劑量為(wei) 每次0.5ml菌液濃度為(wei) ×0~9 cfu／ml的大腸杆菌懸浮液。

    （b） 在大腸杆菌懸液中添加等量的福氏*佐劑、福氏不*佐劑和白油佐劑能明顯加強免疫應答強度，其中福氏*佐劑對免疫應答加強的程度zui高。

    （c） 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、頸背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和頸背肌肉注射8種不同免疫途徑對免疫應答反應強度沒有明顯影響。

    （d） 強化免疫程序能大大加強產(chan) 蛋母雞的免疫應答強度，其中初免後，每隔周強化免疫一次，連續4次，此後每月僅(jin) 用佐劑抗原強化免疫次的強化免疫程序既經濟又有效。

    （2） 采取熱酚法提取E.coli LPS作為(wei) 抗原，以酶標記的兔抗雞IgY抗抗體(ti) （IgG）為(wei) 二抗建立起來的間接ELISA技術檢測特異蛋黃抗體(ti) IgY的抗體(ti) 效價(jia) ，以酶標二抗工作濃度為(wei) ：2000，LPS抗原包被濃度為(wei) ：20（0ug／ml），可以檢測到雞特異IgY抗體(ti) 效價(jia) 為(wei) ：0240。用豬源EHEC和人源沙門氏菌的LPS抗原進行了交叉檢測，表現出高度的特異性。

    （3） 通過對蛋黃抗體(ti) （IgY）的分離純化條件研究發現，乙醇沉澱抗體(ti) 的*條件是粗提液：乙醇（V／V）為(wei) ：0.35；經DEAE-Sephrose fast-flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠排阻層析連續純化後可得到電泳純的抗人大腸杆菌IgY，其MW為(wei) 86400Da（電泳法）或86500Da（凝膠過濾法），該抗體(ti) 由兩(liang) 個(ge) 亞(ya) 基構成，分子質量分別為(wei) 65900Da和24600Da，其等電點為(wei) 5.5。

    （4） 通過穩定性研究發現： （a） 抗人大腸杆菌IgY抗體(ti) 在高溫下（≥75℃）容易發生熱變性，其熱變性的反應級數為(wei) .5，其熱變性溫度點為(wei) 75.0℃。

    （b）抗人大腸杆菌抗體(ti) 在酸性環境容易發生變性，而在中性和弱堿性環境中能較好的保 持穩定，其主要變性發生在pH2.5一3.0。

    （c）、和對抗人大腸杆菌抗體(ti) 的活性保持均有不利的作 用，但發現，經上述3種消化道蛋白質水解酶部分作用後形成的抗體(ti) 水解物仍具有一定的抗 體(ti) 活性。進一步研究確定，在灌胃後lh內(nei) ，小腸內(nei) 抗體(ti) 活性基本保持在zui高水平，而在Zh 之後，抗體(ti) 活性大幅度下降，在灌胃後6h已經下降到了非常低的水平。

    （d）將抗人大腸杆菌抗體(ti) 貯存在O℃和4℃是比較合適的，若貯存在25℃以上的溫度下， 抗體(ti) 活性損失隨貯存期的延長而不斷下降。

    （e）加熱處理、蛋白酶處理以及冷凍幹燥處理對抗體(ti) 的活性都有不利的影響，但一定濃 度的乳糖、環糊精和糊精能加強抗體(ti) 對熱處理和蛋白酶處理的穩定性，而環糊精、乳糖、糊 精、果糖、葡萄糖、和甘油都能不同程度的加強抗體(ti) 在冷凍幹燥過程中的穩定性。

    （5）通過對抗人大腸杆菌免疫蛋黃抗體(ti) 的功能及其機理探討發現，抗人人腸杆菌卵黃抗體(ti) 濃度大於(yu) sm留ml，可對大腸杆菌有明顯的體(ti) 外抑菌作用;抗人大腸杆菌IgY對大腸杆菌誘導 的乳鼠腸道感染具有顯著的預防和治療作用;抗人大腸杆菌卵黃抗體(ti) 可抑製大腸杆菌對腸上 皮細胞粘附作用，隨著大腸杆菌濃度的不斷升高，粘附率不斷增加，上皮細胞濃度的增加能 提高ETEC對其的粘附率。

    （6）研究發現，4.0 kGy的“。c。丫射線可使蛋中可能汙染的微生物全部滅活，而不影響 抗體(ti) 活性;雞抗人大腸杆菌抗體(ti) 對臨(lin) 床檢查、血液學、生化學、器官重量、係數及組織病理 學等指標無明顯影響，證明雞蛋黃抗體(ti) IgY無急、‘漫性毒副作用:通過骨髓嗜染紅細胞微核 試驗、小鼠精子畸形試驗及Ames試驗，結果證明雞抗人大腸杆菌抗體(ti) 無細胞毒，無致突變作 用。