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　   ELISA是以免疫學反應為(wei) 基礎，將抗原、9體(ti) 的特異性反應與(yu) 酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於(yu) 抗原、抗體(ti) 的反應在一種固相載體(ti) ──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘(yu) 的遊離反應物，從(cong) 而保證試驗結果的特異性與(yu) 穩定性。      在實際應用中，通過不同的設計，具體(ti) 的方法步驟可有多種。即:用於(yu) 檢測抗體(ti) 的間接法、用於(yu) 檢測抗原的雙抗體(ti) 夾心法以及用於(yu) 檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭(zheng) 法等等。比較常用的是ELISA雙抗體(ti) 夾心法及ELISA間接法。 原理如下： ①使抗原或抗體(ti) 結合到某種固相載體(ti) 表麵，並保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體(ti) 與(yu) 某種酶連接成酶標抗原或抗體(ti) ，這種酶標抗原或抗體(ti) 既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體(ti) 或抗原）和酶標抗原或抗體(ti) 按不同的步驟與(yu) 固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 起反應。用洗滌的方法使固相載體(ti) 上形成的抗原抗體(ti) 複合物與(yu) 其他物質分開，最後結合在固相載體(ti) 上的酶量與(yu) 標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為(wei) 有色產(chan) 物，產(chan) 物的量與(yu) 標本中受檢物質的量直接相關(guan) ，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於(yu) 酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從(cong) 而使測定方法達到很高的敏感度。         操作步驟 　　方法一　用於(yu) 檢測未知抗原的雙抗體(ti) 夾心法: 　　1.　包被：用0.05M PH9.�碳酸鹽包被緩衝(chong) 液將抗體(ti) 稀釋至蛋白質含量為(wei) 1～10μg／ml。在每個(ge) 聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。 　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 　　3.　加酶標抗體(ti) ：於(yu) 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(ti) (經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 　　4.　加底物液顯色：於(yu) 各反應孔中加入臨(lin) 時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。 　　5.　終止反應：於(yu) 各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　結果判定：可於(yu) 白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nei) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為(wei) 無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O・D值：在ELISA檢測儀(yi) 上，於(yu) 450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O・D值，若大於(yu) 規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為(wei) 陽性。 　　方法二　用於(yu) 檢測未知抗體(ti) 的間接法： 　　　　　　用包被緩衝(chong) 液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體(ti) )0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔 　　　　　　中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照) 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　於(yu) 反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(ti) (抗抗體(ti) )0.1ml， 　　　　　　37℃孵育30-60分鍾，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　其餘(yu) 步驟同“雙抗體(ti) 夾心法”的4、5、6。 　　(三)　試劑器材 　　1.　試劑 　　(1)　包被緩衝(chong) 液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝(chong) 液): 　　　　　　NaCO３1.59克 　　　　　　NaHCO３　 2.93克 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(2)　洗滌緩衝(chong) 液(PH7.4 PBS)：0.15M 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克 　　　　　　Na2HPO４・12H2O　　2.9克 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(3)　稀釋液： 　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 　　　　　　　加洗滌緩衝(chong) 液至100ml 　　　　或以羊血清、兔血清等血清與(yu) 洗滌液配成5～10％使用。 　　(4)　終止液(2M　H２SO４）： 　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。 　　(5)　底物緩衝(chong) 液(PH5.0磷酸 檸檬酸): 　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml 　　　　0.1M 檸檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml 　　　　加蒸餾水50ml。 　　(6)　TMB(四甲基聯苯胺)使用液: 　　　　TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml 　　　　底物緩衝(chong) 液(PH5.5)　　　 10ml 　　　　0.75％H２O２　　 　32μl 　　(7)　ABTS使用液: 　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg 　　　　底物緩衝(chong) 液(PH5.5)　 1ml 　　　　3％H２O２　 　2μl 　　(8)　抗原、抗體(ti) 和酶標記抗體(ti) 。 　　(9)　正常人血清和陽性對照血清。 　　2.　器材: 　　(1)　聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀(yi) ，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。 　　(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。 　　(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。