跨膜蛋白SEMA5A抗體抗體的生物素化標記實驗要點

跨膜蛋白SEMA5A抗體(ti) 抗體(ti) 的生物素化標記實驗要點:

1. 如在反應混合液中有疊氮鈉或遊離氨基存在,會(hui) 抑製標記反應。因此,蛋白質在反應前要對 0.1mol/L碳酸氫鈉緩衝(chong) 液或0.5mol/L硼酸緩衝(chong) 液充分透析;

2.所用的NHSB及待生物素化蛋白質之間的分子比按蛋白質表麵的ε-氨基的密度會(hui) 有所不同,選擇不當則影響標記的效率,應先用幾個(ge) 不同的分子比來篩選最適條件;

3.用NHSB量過量也是不利的,抗原的結合位點可能因此被封閉,導致抗體(ti) 失活;

4.由於(yu) 抗體(ti) 的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此時可加入去汙劑如 Triton x-100, Tween20等;

5.當遊離ε-氨基(賴氨酸殘基的氨基)存在於(yu) 抗體(ti) 的抗原結合位點時,或位於(yu) 酶的催化位點時,生物素化會(hui) 降低或損傷(shang) 抗體(ti) 蛋白的結合力或活性;

6.生物素還可能與(yu) 不同的功能基團,如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基,也可與(yu) 糖基共價(jia) 結合;

7.交聯反應後,應充分透析,否則,殘餘(yu) 的生物素會(hui) 對生物素化抗體(ti) 與(yu) 親(qin) 和素的結合產(chan) 生競爭(zheng) 作用;

8.在細胞的熒光標記實驗中,中和親(qin) 和素的本底低,但由於(yu) 鏈黴親(qin) 和素含有少量正電荷,故對某些細胞可導致高本底。