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羊抗兔IgG(全分子)-FITC抗體(ti) *,羊抗兔IgG(全分子)-FITC抗體(ti) 用於(yu) 免疫組化實驗,WB實驗,相應的標記抗體(ti) 有HRP標記抗體(ti) ,FITC標記,BIO等。
【貯存條件】: 貯存於(yu) -20℃. 本品應在低溫下保存,長時間在暴露在空氣中,含量會(hui) 有所降低。
規格:0.5ml/ml
材料和方法
. 材料 人成骨肉瘤MG63細胞為(wei) 本實驗室保存。重組質粒MycSSHL(WT)、MycSSHL(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王岩教授惠贈。脂質體(ti) 2000( Invitrogen公司)。高糖DMEM培養(yang) 基(美國Gibco 公司),胎牛血清(Hyclone公司),和EDTA(Sigma 公司)。A2387,KN93,CaM,重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain,Calbiochem)。抗體(ti) :Myc (9E0;Roche),HA (3F0;Roche),Pcofilin,Cofilin(Santa Cruz), CaMKⅡδδ4 (Trans Genic Inc.),PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉澱(Protein Gagarose)試劑盒(邁晨科技有限公司)。
.2 蛋白印跡實驗 MG63細胞鋪於(yu) 35 mmol/L培養(yang) 皿中,待細胞密度達到60%~70%時,轉染MycSSHL,48 h後換無血清培養(yang) 基培養(yang) 3 h,分別加入濃度為(wei) 0.5,,2.5,5 μmol/L的A2387孵育0 min後裂解細胞,離心取上清加入凝膠加樣緩衝(chong) 液,沸水浴上加熱5 min,上樣、電泳、轉膜、雜交〔一抗分別為(wei) Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(4)〕、ECL顯色。
.3 體(ti) 外激酶測定 MycSSHL(WT)及其突變體(ti) MycSSHL(2 SA)分別轉染至MG63細胞,48 h後采用免疫共沉澱(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體(ti) ,對照組為(wei) 抗IgG抗體(ti) 。回收MycSSHL,加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨或同時加入抑製劑KN93)以及00 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 於(yu) 20 μl 激酶反應緩衝(chong) 液中,30℃反應40 min。反應產(chan) 物進行SDSPAGE電泳、轉膜,應用放射自顯影技術檢測32P 標記的SSHL水平。
.4 體(ti) 外SSHL磷酸酶活性測定實驗 MycSSHL(WT)或MycSSHL (2 SA)轉染至MG63細胞,48 h後,采用免疫共沉澱(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體(ti) ,對照組為(wei) 抗IgG抗體(ti) 。回收MycSSHL,加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨或同時加入抑製劑KN93),20 μg/ml CaM,以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 於(yu) 20 μl 反應緩衝(chong) 液(50 mol/L HEPES,pH 7.4,0. mol/L CaCl2,0.5 mol/L EDTA,3 mol/L MgCl2,00 mmol/L NaCl, mol/L dithiothreitol,0.5 mg/ml BSA, μg/ml leupeptin),中30℃反應2 h。反應產(chan) 物進行SDSPAGE電泳、轉膜、雜交(一抗分別為(wei) Pcofilin,Cofilin, cmyc 抗體(ti) )、ECL顯色。
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