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鼠抗人B淋巴細胞抗原單克隆抗體(ti) B Lymphocyte Antigen 36kDa Western Blot技術:
一、 原理
與(yu) Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體(ti) ，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(ti) （例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體(ti) 以非共價(jia) 鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體(ti) 上的蛋白質或多肽作為(wei) 抗原，與(yu) 對應的抗體(ti) 起免疫反應，再與(yu) 酶或同位素標記的第二抗體(ti) 起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於(yu) 檢測蛋白水平的表達。
二、分類 鼠抗人B淋巴細胞抗原單克隆抗體(ti) B Lymphocyte Antigen 36kDa 現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體(ti) 同水平和實驗條件的是用*種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。隻要買(mai) 現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為(wei) 過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
三、 主要試劑
、 丙烯酰胺和N，N’-亞(ya) 甲雙丙烯酰胺，應以溫熱（以利於(yu) 溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配製含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞(ya) 甲雙丙烯酰胺儲(chu) 存液丙稀酰胺29g，N，N-亞(ya) 甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chu) 於(yu) 棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yan) 格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩(liang) 個(ge) 月，隔幾個(ge) 月須重新配製。如有沉澱，可以過濾。 B Lymphocyte Antigen 36kDa 、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配製，室溫保存。
3、 分離膠緩衝(chong) 液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體(ti) 積。過濾後40℃保存。
4、 濃縮膠緩衝(chong) 液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu) 40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到00ml終體(ti) 積。過濾後40C保存。這兩(liang) 種緩衝(chong) 液必須使用Tris堿製備，再用HCL調節PH值，而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩(liang) 種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑製。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩(liang) 種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配製數ml，臨(lin) 用前配製.
6、 SDS- PAGE加樣緩衝(chong) 液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩衝(chong) 液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與(yu) 蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻後再上樣，一般為(wei) 20-25ul，總蛋白量00μg。
7、 Tris-甘氨#電泳緩衝(chong) 液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩衝(chong) 液。臨(lin) 用前稀釋0倍。
8、 轉移緩衝(chong) 液：配製L轉移緩衝(chong) 液，需稱取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入200ml甲醇，加水至總量L。
9、 麗(li) 春紅染液儲(chu) 存液：麗(li) 春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時上述儲(chu) 存液稀釋0倍即成麗(li) 春紅S使用液。使用後應予以廢棄。
0、 脫脂奶粉5%（w/v）。
、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶於(yu) 磷#緩衝(chong) 鹽溶液（PBS）。
2、 Tris緩衝(chong) 鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。
3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。
4、 過氧化物酶標記的第二抗體(ti) 。
5、 NBT（溶於(yu) 70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。
6、 BCIP（溶於(yu) 00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。
7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。
8、 00mmol/L NaCl。
9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。
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