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【產(chan) 品名稱】牛棒杆菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒
Name ：Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
【型號：】GOY-M4152
【包裝規格】50次/盒 
【預期用途】牛棒狀杆菌病(Bovine Corynebacteriosesis)是指由棒狀杆菌屬(Corynebacterium spp.)的某些細菌引起的膀胱炎和腎盂腎炎。臨(lin) 床主要特征為(wei) 頻尿、濁尿、血尿和發熱。該病主要見於(yu) 成年母牛，多在妊娠期和產(chan) 後發病。本病分布於(yu) 世界各地。因此快速靈敏檢測牛棒杆菌具有重要意義(yi) 。本產(chan) 品就是為(wei) 此目的根據 PCR 原理開發的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶隻需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優(you) 化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便於(yu) 區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據牛棒杆菌高度保守區設計，不會(hui) 跟其他細菌的 DNA 發生交叉反應。
5. 本產(chan) 品足夠 50 次 20μL 體(ti) 係的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產(chan) 品隻能用於(yu) 科研。
【規格及成分】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
熒光 PCR 專(zhuan) 用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
牛棒杆菌探針法 qPCR 引物混 合液 | 100 μL（白蓋） |
牛棒杆菌 qPCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
牛棒杆菌探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊(ce) | 1份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為(wei) 12 個(ge) 月。
【自備試劑】樣品 DNA。
【使用方法】一、稀釋標準曲線樣品
（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(ge) 10 倍稀釋度為(wei) 例）。 由於(yu) 標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬(wan) 不能 汙染樣品或本試劑盒的其他成分）。為(wei) 增加產(chan) 品穩定性和避免擴散傳(chuan) 染性病原，本產(chan) 品不提供活體(ti) 樣品做陽性對照，隻提供無傳(chuan) 染性的 DNA 片段作為(wei) 陽性對照。
1. 標記 6 個(ge) 離心管，分別為(wei) 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuan) 用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鍾，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鍾，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鍾，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重複上麵的操作直到得到 6 個(ge) 稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
牛棒杆菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒二、樣品 DNA 的製備
7. 如果有 N 個(ge) 樣品，設置 N+2 個(ge) 提取，多出的一個(ge) 是 PC（樣品製備陽性 對照），一個(ge) 是 NC（樣品製備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體(ti) 積跟每次製備要求的體(ti) 積一樣，以此作為(wei) PC。另外用水作為(wei) NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式細菌DNAout。本試劑盒免費贈送 20次免DNA 提取的核酸釋放劑，本產(chan) 品的裂解液可以直接作為(wei) PCR 模板，省略 了 DNA 提取步驟。
三、、Probe qPCR 反應（20μL 體(ti) 係，在樣品製備室進行）
9. 如果做定量分析並且隻做 1 次重複，則標記 N+9 個(ge) PCR 管，其中 N+2 個(ge) 用於(yu) 上步得到的 N+2 個(ge) 樣品，1 個(ge) 用於(yu) PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(ge) 用於(yu) 標準曲線。如果做定性分析，並且隻做 1 次重複，則標記 N+4 個(ge) PCR 管，其中 N+2 個(ge) 用於(yu) 上步得到的 N+2 個(ge) 樣品，1 個(ge) 用於(yu) PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(ge) 用於(yu) PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下麵隻以定量分析為(wei) 例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表隻列出一次重複。樣品管和陰性對照設 置完畢後才設置陽性對照，並且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chu) 存好後最後加）：
成分/每管 | 樣品管 N+2 個(ge) | RT-PCR 陰性對照 | 標準曲線樣品管 （1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
牛棒杆菌 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
牛棒杆菌探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
N+2 個(ge) 待測 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
超純水 | - | 7 μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） | - | - | 各 7 μL（2 號樣到2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應 （40 個(ge) 循環） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的熒光信號） |
12. 如果把本試劑盒用於(yu) 定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為(wei) 橫軸，以 Ct 值為(wei) 縱軸，繪製標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從(cong) 標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用於(yu) 定性檢測，隻判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 於(yu) 或等於(yu) 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小於(yu) 或等於(yu) 30。對待測樣品，如果其 Ct 大於(yu) 或等於(yu) 40 則為(wei) 陰性，如果小於(yu) 或等於(yu) 35 則為(wei) 陽性。如果在 35-40 之間，則重複一次。重複實驗的 Ct 值如果大於(yu) 或等於(yu) 40 則為(wei) 陰性，如果小於(yu) 40，則為(wei) 陽性。
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