酰基轉移酶重組蛋白的誘導

操作方法

*酰基轉移酶重組蛋白的誘導

1. 接種含有重組*酰基轉移酶蛋白的大腸杆菌BL21菌株於(yu) 5mL LB液體(ti) 培養(yang) 基中（含100ug/mL 氨苄*），37℃震蕩培養(yang) 。

2. 轉接1mL培養(yang) 物於(yu) 100mL（含100ug/mL 氨苄*）LB液體(ti) 培養(yang) 基中，37℃震蕩培養(yang) 至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用於(yu) SDS-PAGE 分析。

3. 加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l, 37℃繼續培養(yang) 1-3h.

4. 12，000rpm 離心10 min, 棄上清，菌體(ti) 沉澱保存於(yu) -20℃或-70℃冰箱中。

*酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化

1. NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1mL NTA介質，並分別用8mL 去離子水，8mL上樣緩衝(chong) 液洗滌。

2. 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體(ti) 沉澱，加入5mL上樣緩衝(chong) 液, 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體(ti) ，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min, 4℃ 12000rpm 離心 30 min, 將上清吸至一個(ge) 幹淨的容器中，並棄沉澱。取10ul 上清樣品用於(yu) SDS-PAGE 分析。

3. 上清樣品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul樣品用於(yu) SDS-PAGE 分析。

4. 洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脫液，約3-4h,取10ul洗脫開始時的樣品用於(yu) SDS-PAGE 分析。

5. 洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10ul樣品用於(yu) SDS-PAGE 分析。