ELISA酶聯試劑盒的基本原理

ELISA酶聯試劑盒的基本原理

(一)用於(yu) 標記的酶 用於(yu) 標記抗體(ti) 或抗抗體(ti) 的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產(chan) 物易於(yu) 顯現；能商品化生產(chan) 。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用zui廣。
.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布於(yu) 植物中，辣根中含量zui高，從(cong) 辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量8%），分子量約40 000，約由300個(ge) 氨基酸組成，等電點為(wei) pH 3-9，催化反應的zui適pH值因供氫體(ti) 不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶於(yu) 水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為(wei) 275nm和403nm。
hth体育下载地址酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，zui高為(wei) 3.4。RZ在0.6以下的酶製品為(wei) 粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用於(yu) 標記。RZ在2.5以上者方可用於(yu) 標記。HRP的作用底物為(wei) 過氧化氫，催化反應時的供氫體(ti) 有幾種：（）鄰苯二胺（OPD），產(chan) 物為(wei) 橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內(nei) 不改變,是目前國內(nei) ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)中zui常用的一種；（2）聯大茴香胺（OD）,產(chan) 物為(wei) 橘黃色，zui大吸收值在400nm，顏色較穩定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chan) 物為(wei) 深棕色，zui大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯甲苯胺（OT）產(chan) 物為(wei) 藍色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 係從(cong) 小牛腸粘膜和大腸杆菌中提取，由多個(ge) 同功酶組成。它們(men) 的底物種類很多，常用者為(wei) 硝基苯磷酸鹽，廉價(jia) 無毒性。酶解產(chan) 物呈黃色，可溶，zui大吸收值在400nm。酶的活性以在pH0反應係統中，37℃分鍾水解μg磷酸苯二鈉為(wei) 一個(ge) 單位。

(二) 基本原理 hth体育下载地址(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與(yu) 抗體(ti) 或抗抗體(ti) 分子共價(jia) 結合，此種結合不會(hui) 改變抗體(ti) 的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體(ti) 可與(yu) 吸附在固相載體(ti) 上的抗原或抗體(ti) 發生特異性結合。滴加底物溶液後，底物可在酶作用下使其所含的供氫體(ti) 由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與(yu) 標本中相應抗體(ti) 或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀(yi) 進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體(ti) 反應的特異性結合起來，使hth体育下载地址(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法成為(wei) 一種既特異又敏感的檢測方法。

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