ELISA檢測氧化耦聯色原底物對以及還原色原底物

ELISA檢測氧化耦聯色原底物對以及還原色原底物

、氧化耦聯色原底物對
HRP的氧化耦聯色原底物對主要有4—氨基：耦聯底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯並噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存在下，4—氨基和經HRP作用縮合形成紅色的醌亞(ya) 胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）。
該耦聯色原底物對用於(yu) 固相ELISA時，敏感性一般較低，反應見光不穩定，而且易發生多聚化，缺乏適當的反應終止劑。因此，該試劑常限於(yu) 葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨(lin) 床生化指標的酶法檢測應用。989年日本學者用其作為(wei) 色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應。但這種方法僅(jin) 停留在實驗室階段，其後也未見有其他實驗室的應用報道，可能還有其固有的缺陷。
—氨基：耦聯底物對色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：將4—氨基以2 mmol/L，以25 mmol/L和H202以0.8 mmol/L的濃度溶於(yu) 0. mol/L磷酸鹽緩衝(chong) 液（pH7.2），即可應用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），zui大吸收波長為(wei) 590nm，見光不穩定。用鹽酸或硫酸終止反應後，pH應為(wei) 3.0左右，pH值的降低使顯色從(cong) 紫藍色轉變為(wei) 清晰的藍色，zui大吸收波長從(cong) 590nm變為(wei) 595nm，然而pH值的進一步降低，將導致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。

、氧化還原色原底物
OPD被認為(wei) 是HRPzui為(wei) 敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫（H202）氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5.0左右時，DAB在波長450nm處有廣範圍的zui大吸收，當pH值降為(wei) .0時，zui大吸收波長移動至492nm，同時摩爾消光係數變大，顯色加深（圖4—2）。因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。實際工作中，用強酸尤其是鹽酸終止反應後，顯色並不穩定，常隨時間增長而顏色加深，這是由於(yu) 反應後剩餘(yu) 的過氧化氫繼續氧化OPD而產(chan) 生非酶催化的DAB的結果。有人在強酸反應終止液中加入還原劑如亞(ya) 硫酸鈉，因還原劑可迅速*地將剩餘(yu) 的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結果顯色穩定，數十小時內(nei) 不變，而且無需避光。OPD的缺點是其對機體(ti) 具有致突變作用。由於(yu) OPD的不穩定性，現在的商品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應，臨(lin) 用時再溶解於(yu) 相應的緩衝(chong) 液。
在ELISA測定時，OPD色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：在0.mol/L枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和2 mmol/L H202，或0 mmol/L OPD和5.5mmol/L H202；②終止液：2 mol/L硫酸（含0. mol/L亞(ya) 硫酸鈉）；③測定波長：492nm。
TMB是一種優(you) 於(yu) OPD的新型HRP色原底物。其氧化產(chan) 物聯苯醌在波長450nm處有zui大消光係數，如果HRP量少，和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為(wei) 黃色的聯苯醌（圖4—3）。使用硫酸作為(wei) 終止劑可使產(chan) 物穩定90min，但隨後本底顯色就不斷加深，國內(nei) 有人認為(wei) 使用％SDS作為(wei) 終止劑，可使鮮藍色24h內(nei) 保持不變，陰陽性對比十分明顯，但在我們(men) 實驗室發現％SDS對上述顯色有較強的褪色作用，目前仍以硫酸作為(wei) 終止劑較為(wei) 理想。ELISA中，底物反應顯色後，常選擇其具zui大吸收的波長450nm比色測定結果。而’Madersbacher和Berger等為(wei) 提高以TMB作底物的ELISA測定的敏感性，選擇顯色呈指數加深時的波長405nm比色測定。他們(men) 首先測定一係列已知濃度的標準品在450nm和405nm的值，證實A450nm/A405nm之比為(wei) 3.2，然後在使用波長405nm測定含低濃度待測物的標本得到的OD值再乘以常數3.2，即為(wei) 待測標本在波長450nm處的真值。該種雙波長測定方法可使ELISA測定範圍提高3倍。TMB的顯色反應雖與(yu) OPD一樣同屬氧化還原反應，但前者的反應是可逆的，如終止液中存在還原劑（及亞(ya) 硫酸鈉、SDS等），則可反應顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對較低，但由於(yu) 其高檢測敏感性及無致突變作用，現已基本上取代了OPD而成為(wei) HRPzui為(wei) 常的色原底物。
在商品hth体育下载地址尤其是國內(nei) 的產(chan) 品中，TMB色原底物常為(wei) 已配好的A及B兩(liang) 種液態試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為(wei) TMB溶液，鑒於(yu) 過氧化氫、TMB在溶液中相對不穩定的特點，因此，我們(men) 在使用hth体育下载地址時，如發現底物A和（或）B出現顏色，或二者各取一滴混合後顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質或已受汙染，必須廢棄。
在ELISA測定時，TMB色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：先將TMB以0. mol/L的濃度溶於(yu) 二甲亞(ya) 碸，然後，再將其以 mmol/L和H202以3.0 mmol/L的濃度溶於(yu) 0.2mol/L醋酸鈉/枸櫞酸緩衝(chong) 液（pH4.0），即可應用。②終止液：2 mol/L硫酸。③測定波長：450nm。
ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨鹽轉變為(wei) 易發生歧化的陽離子根（圖4—4）。陽離子根為(wei) 綠色，與(yu) OPD的黃色氧化產(chan) 物相比更適於(yu) 可見光測定（測定波長入＝44nm）。上述顯色也不穩定，0 mmol/L疊氮鈉是較為(wei) 理想的終止劑，可使顯色穩定數十小時，且可減少陽離子根的歧化。另有人報道用.25％NaF終止反應效果較好。
ABTS在目前國內(nei) 的hth体育下载地址中基本上沒有應用，但在國外hth体育下载地址偶見有應用。
在ELISA測定時，ABTS色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol/L和H202以2.5 mmo!/L的濃度溶於(yu) 0. mol/L醋酸鹽緩衝(chong) 液（pH 4.2），即可應用；②終止液：0 mmol/L疊氮鈉；③測定波長；44nm或405nm。
除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等。