細胞表麵抗原-流式細胞檢測的步驟如下

細胞表麵抗原-流式細胞檢測的步驟如下

.實驗材料：檢測管或96微孔板 一抗（FITC標記），以表記Anti-CD9/FITC抗體(ti) 為(wei) 例 緩衝(chong) 液：PBS（PH7.4） 設備：移液器、離心機、冰盒或冰箱、流式細胞儀(yi) 2. 注意事項：標記抗體(ti) 在使用之前用PBS溶解並振勻，並確認沒有沉澱，迅速離心幾秒，使所有的液體(ti) 都集中到管底，標記抗體(ti) 應避光4℃保存，避免凍結，因樣本的固定保存或較長時間放置可能會(hui) 影響細胞表麵分子和抗體(ti) 之間的結合，故建議盡可能使用新鮮樣品。 3. 操作方法： 一. 以大鼠淋巴組織細胞表麵抗原的流式檢測步驟為(wei) 例 樣品製備： 取出大鼠淋巴組織塊，迅速浸泡在0ml的緩衝(chong) 液中，並用注射器的活塞研磨或使用兩(liang) 塊預冷的載玻片研壓成單細胞。 把懸液轉移到50ml的錐形管中靜置片刻，使細胞團塊和碎片沉降到管底，並通過尼龍網過濾成單細胞懸液。 在4℃下300-400g離心4-5分鍾，除去上清液。 如果該樣品為(wei) 脾髒細胞，加入一定量的RBC lysis裂解紅細胞，或者用分離液分離出淋巴細胞。若為(wei) 其它樣品，不用此步驟。 加入50ml 緩衝(chong) 液重懸細胞後計數，根據需要用台盼藍(Trypan Blue)進行細胞活性檢測。 離心細胞液並除去上清；用適量的緩衝(chong) 液重懸細胞為(wei) 2×07個(ge) /ml。采用直接標記的一抗，則加入CD9/FITC抗體(ti) （0.5-ug/06細胞）冰上孵育5-0分鍾。 細胞熒光染色步驟: . 在每個(ge) 流式檢測管或板式微孔中加入50ul的稀釋後的一抗；在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩衝(chong) 液。若進行抗體(ti) *濃度測試，建議範圍2-0.03ug/06細胞。 2. 在各管/孔中分別加入50ul細胞懸液（約06細胞），並輕輕混勻。 3. 避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鍾。 （注意：有些抗體(ti) 可能需要更長的孵育時間，建議實驗者進行預試驗摸索） 4. 孵育完成後，加入緩衝(chong) 液（每流式檢測管中加2ml，而每微孔中加200ul） 4℃下300-400g離心5分鍾，並棄去上清。 5. 重複洗滌過程3次。 6. 重懸細胞後上流式儀(yi) 檢測。 7. 使用直接標記一抗，用500ul 緩衝(chong) 液重懸細胞後上機檢測。 若使用的一抗是純化或標記抗體(ti) ，則每管/孔加入50-00ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親(qin) 和素（用緩衝(chong) 液稀釋成合適的濃度）後於(yu) 冰浴或在4℃冰箱中避光孵育5-30分鍾。洗滌細胞兩(liang) 次（參考第4步和第5步方法）。之後500ul緩衝(chong) 液重懸細胞，並上機檢測。 8. 試驗結果分析：（注：若要對多個(ge) 細胞表麵抗原進行多色標記，則同時加入熒光標記抗體(ti) 後按以上操作步驟進行孵育和細胞洗滌；操作盡量保持在避光和4℃左右的溫度下進行） 二．以人外周血細胞表麵抗原的流式檢測步驟為(wei) 例 . 在每個(ge) 流式檢測管或板式微孔中加入50ul的熒光標記或標稀釋後的一抗（抗體(ti) 用緩衝(chong) 液稀釋成合適的濃度）；在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩衝(chong) 液。 2. 每管分別加入00ul全血，並輕輕混勻。 3. 避光孵育5-30分鍾。 （注：有些結合能力較低的抗體(ti) 可能需要更長的孵育時間，建議實驗者進行預試驗摸索） 4. 每管分別加入2ml RBC lysis Buffer（之前預熱恢複至室溫），混合均勻。 5. 室溫避光孵育0分鍾，此孵育時間不要超過5分鍾。 6. 室溫300-400g離心5分鍾，並棄去上清。 7. 用2ml 緩衝(chong) 液洗滌細胞一次。 8. 重懸細胞後上流式儀(yi) 檢測。 9. 若使用的一抗是熒光直接標記抗體(ti) ，用500ul 緩衝(chong) 液或2%的多聚甲醛固定液重懸細胞後上機檢測。 若使用的一抗是純化或標記抗體(ti) ，則每管/孔加入50-00ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親(qin) 和素（用緩衝(chong) 液稀釋成合適的濃度）後於(yu) 室溫避光孵育5-30分鍾。洗滌細胞-2次（參考第7步方法）。之後500ul或2%的多聚甲醛固定液重懸細胞，並上機檢測。 0. 試驗結果分析。