大鼠補體片段3b（C3b）試劑盒檢測原理

大鼠補體(ti) 片段3b（C3b）試劑盒檢測原理

檢測原理
大鼠補體(ti) 片段C3b試劑盒采用雙抗體(ti) 一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠補體(ti) 片段3b（C3b）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體(ti) ，經過溫育並*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠補體(ti) 片段3b（C3b）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

.  血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液後，3000轉離心0分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鍾取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心0分鍾去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心0分鍾取上清。

5.  保存：如果樣本收集後不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存於(yu) -20℃，避免反複凍融，在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項

.  大鼠補體(ti) 片段C3b試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鍾。從(cong) 冰箱取出的濃縮洗滌液會(hui) 有結晶，這屬於(yu) 正常現象，水浴加熱使結晶*溶解後再使用。

2.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫幹燥）保存。

3.  預處理後的樣本無需稀釋，直接取0μL加樣即可。

4.  嚴(yan) 格按照說明書(shu) 中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  所有液體(ti) 組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為(wei) ：500、250、25、62.5、3.2、0pg/ml.

試劑的準備

20×洗滌緩衝(chong) 液的稀釋：蒸餾水按：20稀釋，即份的20×洗滌緩衝(chong) 液加9份的蒸餾水。

洗板方法

.  手工洗板：甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，靜置min後甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，在吸水紙上拍幹，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5次。

操作步驟

.  從(cong) 室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘(yu) 板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什麽(me) 都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨後標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體(ti) 00μL，，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體(ti) ，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。

7.  所有孔加入終止液50μL，5min內(nei) ，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

繪製標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪製出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

大鼠補體(ti) 片段C3b試劑盒性能

.  準確性：標準品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值，大於(yu) 等於(yu) 0.9900。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小於(yu) .0 pg/ml。

3.  特異性：不與(yu) 其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 5%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(ge) 月

7.  檢測範圍：5.6 pg/ml -500pg/ml