PCR反應條件-穀研生物

）PCR反應成分
）模板
  單、雙鏈DNA均可。
  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑製劑、DNA結合蛋白類。
  DNA模板一般00ng /00?L。
  模板濃度過高會(hui) 導致反應的非特異性增加。

2）引物濃度
      0.-0.5 ?mol/L
    濃度過高易導致模板與(yu) 引物錯配,反應特異性下降。

（3）Taq DNA聚合酶
      0.5-2.5 U/50 ?l
    酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chan) 量。
 

4）dNTP（0mM or 2.5mM ）
     含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
    dNTP濃度取決(jue) 於(yu) 擴增片段的長度
    濃度過高易產(chan) 生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產(chan) 量
    dNTP可與(yu) Mg2+結合,使遊離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。
5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。濃度為(wei) 0.5-2.5mmol/L。
   Mg2+濃度過低會(hui) 使Taq酶活性喪(sang) 失、PCR產(chan) 量下降； Mg2+過高影響反應特異性。
   Mg2+可與(yu) 負離子結合,所以反應體(ti) 係中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中遊離的Mg2+濃度。
2）循環參數
變性 
    使雙鏈DNA解鏈為(wei) 單鏈
    94℃， 30-60秒
（2） 退火 
    溫度由引物長度和GC含量決(jue) 定。
    增加溫度能減少引物與(yu) 模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。
引物設計：
（）序列應位於(yu) 高度保守區,與(yu) 非擴增區無同源
    序列。
（2）引物長度以5-40 bp為(wei) 宜。
（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占40-60%。
（4）引物內(nei) 部避免形成二級結構。
（5）兩(liang) 引物間避免有互補序列。
（6）引物3’端為(wei) 關(guan) 鍵堿基；5’端無嚴(yan) 格限製。
3）延伸
      70-75℃,一般為(wei) 72℃
      延伸時間由擴增片段長度決(jue) 定
（4）循環次數
     主要取決(jue) 於(yu) 模版DNA的濃度
      一般為(wei) 25-35次
       次數過多：擴增效率降低
                 錯誤摻入率增加