葡萄孢菌PCR檢測試劑盒說明書(shu)

使用方法：

測定法的靈敏度來自作為(wei) 報告的酶。酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產(chan) 生可供觀察的顯色反應現象。因此該體(ti) 係常被稱為(wei) 酶放大體(ti) 係。

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。   24μg/ml    5號標準品    150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

 12μg/ml    4號標準品    150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

 6μg/ml     3號標準品    150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

 3μg/ml     2號標準品    150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

 1.5μg/ml   1號標準品    150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為(wei) 5倍）。加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。|

3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。   

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體(ti) ，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內(nei) 進行。

實驗規則：

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但有專(zhuan) 業(ye) 人員進行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體(ti) 後，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。

3、要在實驗前1小時將試劑盒從(cong) 冰箱中取出，使各種試劑都恢複到室溫，以使結果更穩定。

4、實驗時，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體(ti) 時速度不能太快，以免產(chan) 生氣泡而使吸取量不準確。

6、吸取液體(ti) 時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體(ti) 加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內(nei) 液體(ti) 接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(hui) 自然流下去。

8、液體(ti) 全部加完後，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體(ti) 。也可以用酶標儀(yi) 的晃動功能。

9、應盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數據的準確性。

10、對結果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存於(yu) 液氮或幹冰，也可以保存於(yu) Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩(liang) 類，探針類是利用與(yu) 靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chan) 物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。