說明書(shu)

特點優(you) 勢：

    1.   特異性：所有產(chan) 品使用的引物均經過詳盡的生物信息學分析，經過GenBank及自建龐大數據庫的比對，確保所用的每一條引物均為(wei) 種屬或血清型特異的基因序列區段，可實現對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到100%。

    2.   重現性：該係列所有產(chan) 品均經過大量實驗菌株的驗證，重現性為(wei) 100%。

    3.   靈敏性：該係列產(chan) 品可實現對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時，可實現對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。

    4.   實用性：檢測範圍廣，涵蓋了對人體(ti) 危害較為(wei) 嚴(yan) 重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現對臨(lin) 床樣品及其他環境取樣的快速檢測，整個(ge) 檢測過程為(wei) 3-4個(ge) 小時。

    5.   優(you) 勢1：序列資源豐(feng) 富，除GenBank公布的序列外，公司還進行了大量菌株的序列破譯，從(cong) 理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(you) 勢2：該係列試劑盒均經過大量的保守性及特異性實驗驗證，憑借公司擁有的豐(feng) 富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經過了20餘(yu) 種標準菌株和臨(lin) 床菌株的保守性驗證及40餘(yu) 種近緣標準菌株和臨(lin) 床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會(hui) 出現任何的假陽性及假陰性報告結果。

PCR使用方法：

一、樣品 DNA 的製備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chan) 品跟市場上絕大多數核酸純化產(chan) 品兼容。

2. 如果有 N 個(ge) 樣品，則需要進行 N+2 個(ge) 樣品提取，多出的一個(ge) 用作樣品製備陽性對照管、另一個(ge) 用作樣品製備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放劑試用裝。則按下麵步驟操作： 

3. 配製溶液 A 工作液。以配製 1mL 工作液（足夠 10 個(ge) 樣品）為(wei) 例：在一幹淨塑料

管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nei) 用完，不要長期放置。一次檢測一個(ge) 樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個(ge) 樣品。如果待測樣品數量為(wei) 其他數字，

配製的溶液 A 工作液的體(ti) 積需要做相應的調整。

4. 在標記好的 N+2 個(ge) 離心管中，加入 1-5mg 固體(ti) 樣品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液體(ti) 樣品（如牛奶）待測樣品。在樣品製備陽性對照中加入 5uL 陽性對照，在樣品製備陰性對照中加入 5uL 水。

5. 在每個(ge) 管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體(ti) 樣品被溶液淹埋，如果是液體(ti) 樣品則震蕩混勻。

6. 95℃保溫 10 分鍾。

7. 待冷卻到常溫後加入 10uL 溶液 B 並混勻得 DNA 釋放液。每個(ge) 樣品得到的 DNA釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。

實驗規則：

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但有專(zhuan) 業(ye) 人員進行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體(ti) 後，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。

3、要在實驗前1小時將試劑盒從(cong) 冰箱中取出，使各種試劑都恢複到室溫，以使結果更穩定。

4、實驗時，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體(ti) 時速度不能太快，以免產(chan) 生氣泡而使吸取量不準確。

6、吸取液體(ti) 時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體(ti) 加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內(nei) 液體(ti) 接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(hui) 自然流下去。

8、液體(ti) 全部加完後，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體(ti) 。也可以用酶標儀(yi) 的晃動功能。

9、應盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數據的準確性。

10、對結果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。

PCR反應流程常規程序

將PCR反應所需的成分配置完後，在PCR儀(yi) 上於(yu) 94-96℃預加熱幾十秒至幾分鍾，使模板DNA充分變性，然後進入擴增循環。在每一個(ge) 循環中，先於(yu) 94℃保持30秒鍾使模板變性，然後將溫度降到複性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鍾，使引物與(yu) 模板充分退火；在72℃保持1分鍾（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(ge) 循環。重複這樣的循環25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最後，在72℃保持3-7min，使產(chan) 物延伸完整，4℃保存。

2．複性（退火）和延伸溫度

複性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guan) 鍵因素，通常在50-60℃之間。具體(ti) 的溫度主要由引物的Tm值決(jue) 定。延伸溫度絕大多數設定為(wei) 72℃。如果複性的溫度很高，可以將延伸溫度和複性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時間

變性步驟一般使用30秒鍾，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。複性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chan) 物的大小決(jue) 定，一般采用1kb用1分鍾來保證充足的時間。

4．循環次數

循環次數主要與(yu) 模板的起始數量有關(guan) ，在模板拷貝數為(wei) 104～105數量級時，循環數通常為(wei) 25～35次。

平台效應（plateaueffect）：PCR擴增過程後期會(hui) 出現的產(chan) 物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產(chan) 生的焦磷酸會(hui) 出現末端產(chan) 物抑製作用，非特異性產(chan) 物或引物的二聚體(ti) 出現非特異性競爭(zheng) 作用，擴增產(chan) 物自身複性，高濃度擴增產(chan) 物變性不*。

5．PCR反應液的配製

PCR反應體(ti) 係的配置方式有時也會(hui) 影響反應的正常進行。常規方法與(yu) 其它酶學反應一樣，在最後加入DNA聚合酶。早期的PCR儀(yi) 沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。

對於(yu) 使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會(hui) 擴增不出產(chan) 物。在遇到這個(ge) 問題時，如果將反應成分分開配製，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體(ti) 積的H2O，B管含緩衝(chong) 液、DNA聚合酶和水，然後再將兩(liang) 管溶液混合起來，可較好地克服這個(ge) 問題。

按照常規的方法配製反應體(ti) 係，有時會(hui) 出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決(jue) 這一問題。將dNTP、緩衝(chong) 液，Mg2+和primer先配製好，然後加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最後加入模板和DNA聚合酶等剩餘(yu) 成分。隻有當PCR反應進入高溫階段後，蠟層熔化，所有反應成分才會(hui) 混合在一起。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存於(yu) 液氮或幹冰，也可以保存於(yu) Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩(liang) 類，探針類是利用與(yu) 靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chan) 物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

試劑使用須知：

（1）請參照相關(guan) 法規、文獻、MSDS等信息，理解並掌握好試劑的特性，再進行安全操作。產(chan) 品僅(jin) 用於(yu) 科研

（2）通常購買(mai) 試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有剩餘(yu) 的話，更加注意其他保管和管理。

（3）萬(wan) 一試劑操作者並非專(zhuan) 業(ye) 技術人員。必須在專(zhuan) 業(ye) 人士的指導監督下進行操作。對於(yu) 使用後的廢棄物，不要或者舊的試劑，應按照相關(guan) 法律法規正當處理。

（4）購買(mai) 後，請務必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒，摔壞的措施和管理體(ti) 製；在使用前再次確認標簽上的注意事項，做好必要的安全對策；對沒有標明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作。