鼠疫杆菌（YP）核酸檢測試劑盒說明書(shu)

技術原理：
DNA的半保留複製是生物進化和傳(chuan) 代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與(yu) 啟動子的參與(yu) 下，根據堿基互補配對原則複製成同樣的兩(liang) 分子挎貝。
       在聚合酶鏈式反應實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以複性成為(wei) 雙鏈。因此，通過溫度變化控製DNA的變性和複性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體(ti) 外複製。（ DNA高溫變性低溫複性）
       發現耐熱DNA聚合同酶－－Taq酶對於(yu) PCR的應用有裏程碑的意義(yi) ，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(ge) 循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於(yu) 臨(lin) 床。
特點優(you) 勢：
    .特異性：所有產(chan) 品使用的引物均經過詳盡的生物信息學分析，經過GenBank及自建龐大數據庫的比對，確保所用的每一條引物均為(wei) 種屬或血清型特異的基因序列區段，可實現對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到00。
    2.   重現性：該係列所有產(chan) 品均經過大量實驗菌株的驗證，重現性為(wei) 00。
    3.   靈敏性：該係列產(chan) 品可實現對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到03cfu/ml時，可實現對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。
    4.   實用性：檢測範圍廣，涵蓋了對人體(ti) 危害較為(wei) 嚴(yan) 重的7種呼吸道及腸道致病菌，可實現對臨(lin) 床樣品及其他環境取樣的快速檢測，整個(ge) 檢測過程為(wei) 3-4個(ge) 小時。
    5.   優(you) 勢：序列資源豐(feng) 富，除GenBank公布的序列外，公司還進行了大量菌株的序列破譯，從(cong) 理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
    6.   優(you) 勢2：該係列試劑盒均經過大量的保守性及特異性實驗驗證，憑借公司擁有的豐(feng) 富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經過了20餘(yu) 種標準菌株和臨(lin) 床菌株的保守性驗證及40餘(yu) 種近緣標準菌株和臨(lin) 床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會(hui) 出現任何的假陽性及假陰性報告結果。
需要自備的器材：
．方法儀(yi) 器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀(yi) 、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL、20
µL、200 µL、000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、.5 mL 經焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（0 µL、200 µL、000 µL）、滅菌雙蒸水。
樣本采集、存放及運輸：
、樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；
2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可保存，但應避免反複凍融（zui多凍融3次）；
3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
組成及試劑配製:
 
、酶標板：一塊（96孔）
 
2、 標準品（凍幹品）： 2瓶，請臨(lin) 用前5分鍾內(nei) 配製。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好後室溫靜置大約0分鍾，同時反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 200 U/L，然後做係列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配製成200 U/L，00 U/L，50 U/L，25 U/L，2.5 U/L，6.25 U/L，3.2 U/L，樣品稀釋液直接作為(wei) 空白孔 0 U/L。如配製00 U/L標準品：取0.3ml （不要少於(yu) 0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。
 
3、 樣品稀釋液：×20ml。
 
4、 檢測稀釋液A：×0ml。
 
5、 檢測稀釋液B：×0ml。   
反應五要素：
 
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
引物：引物是PCR特異性反應的關(guan) 鍵，PCR 產(chan) 物的特異性取決(jue) 於(yu) 引物與(yu) 模板DNA互補的程度。理論上，隻要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體(ti) 外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
 
①引物長度： 5-30bp，常用為(wei) 20bp左右。
 
②引物擴增跨度： 以200-500bp為(wei) 宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。
 
③引物堿基：G+C含量以40-60%為(wei) 宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個(ge) 以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
④避免引物內(nei) 部出現二級結構，避免兩(liang) 條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(hui) 形成引物二聚體(ti) ，產(chan) 生非特異的擴增條帶。
 
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個(ge) 堿基，應嚴(yan) 格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
 
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
 
⑦引物的特異性：引物應與(yu) 核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
 
引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以*引物量產(chan) 生所需要的結果為(wei) 好，引物濃度偏高會(hui) 引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體(ti) 的機會(hui) 。PCR實驗步驟：
①產(chan) 品僅(jin) 用於(yu) 科研取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其*溶解。
②兩(liang) 相分離 每ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體(ti) 5秒後，5到30℃孵育2到3分鍾。4℃下2000rpm離心5分鍾。離心後混合液體(ti) 將分為(wei) 下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於(yu) 水相中。水相上層的體(ti) 積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體(ti) 積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後5到30℃孵育0分鍾後，於(yu) 4℃下2000rpm 離心0分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側(ce) 壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液，每mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配製)，清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鍾。
⑤RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-0分鍾。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存於(yu) -80℃待用。 )紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋(:00)後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
PCR反應的特異性決(jue) 定因素為(wei)
.引物與(yu) 模板DNA特異正確的結合。
2.堿基配對原則。
3. Tag DNA聚合酶合成反應的忠實性。
4.靶基因的特異性與(yu) 保守性。
其中引物與(yu) 模板的正確結合是關(guan) 鍵。引物與(yu) 模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及 Tag DNA聚合醇耐高溫性,使反應中模板與(yu) 引物的結合(複性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大増加加,被擴増的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。
靈敏度高
PCR產(chan) 物的生成量是以指數方式増加的,能將皮克(pg=0-29)量級的起始待測模板擴増到微克(ug=0-69)水平。能從(cong) 00萬(wan) 個(ge) 細胞中檢出一個(ge) 靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個(ge) RFU(空斑形成單位);在細菌學中zu小檢出率為(wei) 3個(ge) 細菌。
(3)簡便、快速
PCR反應用耐高溫的 Tag DNA聚合酶,一次性地將反應液加好後,即在DNA擴増液和水浴鍋上進行變性退火-延伸反應,一般在2-4小時完成擴増反應。擴増產(chan) 物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性汙染、易推廣。
(4)對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yang) 細胞,DNA粗製品及總RNA均可作為(wei) 擴増模板。可直接用臨(lin) 床標本如血液、體(ti) 腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活PCR技術概論。
 
注意事項：   
 
、使用本試劑前請仔細閱讀本說明書(shu) 全文。
 
2 、操作時應盡量少說話，因口腔中也含有支原體(ti) ，可能引起樣品汙染，而造成假陽性；整個(ge) 檢測過程中，反應體(ti) 係的配製、樣本處理及加樣、PCR擴增應分區域進行，以避免交叉汙染。 
 
3 、實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應充分融化並混勻（混勻時禁止激烈振蕩，隻需要進行上下倒置多次進行混勻）。
 
4、 反應管中加好所有的試劑後，應盡快上PCR儀(yi) 進行擴增，以免形成過多的二聚體(ti) 。
 
5、細胞培養(yang) 物中含有和等抗不會(hui) 影響本品的檢測結果。如果用戶需要進一步提高檢測。