細小病毒(PPV)核酸檢測試劑盒說明書(shu)

技術原理：
 DNA的半保留複製是生物進化和傳(chuan) 代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與(yu) 啟動子的參與(yu) 下，根據堿基互補配對原則複製成同樣的兩(liang) 分子挎貝。
       在聚合酶鏈式反應實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以複性成為(wei) 雙鏈。因此，通過溫度變化控製DNA的變性和複性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體(ti) 外複製。（ DNA高溫變性低溫複性）
       發現耐熱DNA聚合同酶－－Taq酶對於(yu) PCR的應用有裏程碑的意義(yi) ，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(ge) 循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於(yu) 臨(lin) 床。
特點優(you) 勢：
    .用特異性：所有產(chan) 品使用的引物均經過詳盡的生物信息學分析，經過GenBank及自建龐大數據庫的比對，確保所用的每一條引物均為(wei) 種屬或血清型特異的基因序列區段，可實現對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到00。
    2.   重現性：該係列所有產(chan) 品均經過大量實驗菌株的驗證，重現性為(wei) 00。
    3.   靈敏性：該係列產(chan) 品可實現對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到03cfu/ml時，可實現對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。
    4.   實用性：檢測範圍廣，涵蓋了對人體(ti) 危害較為(wei) 嚴(yan) 重的7種呼吸道及腸道致病菌，可實現對臨(lin) 床樣品及其他環境取樣的快速檢測，整個(ge) 檢測過程為(wei) 3-4個(ge) 小時。
    5.   優(you) 勢：序列資源豐(feng) 富，除GenBank公布的序列外，公司還進行了大量菌株的序列破譯，從(cong) 理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
    6.   優(you) 勢2：該係列試劑盒均經過大量的保守性及特異性實驗驗證，憑借公司擁有的豐(feng) 富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經過了20餘(yu) 種標準菌株和臨(lin) 床菌株的保守性驗證及40餘(yu) 種近緣標準菌株和臨(lin) 床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會(hui) 出現任何的假陽性及假陰性報告結果。
反應五要素：
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關(guan) 鍵，PCR 產(chan) 物的特異性取決(jue) 於(yu) 引物與(yu) 模板DNA互補的程度。理論上，隻要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體(ti) 外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 5-30bp，常用為(wei) 20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為(wei) 宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為(wei) 宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個(ge) 以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nei) 部出現二級結構，避免兩(liang) 條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(hui) 形成引物二聚體(ti) ，產(chan) 生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個(ge) 堿基，應嚴(yan) 格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與(yu) 核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以引物量產(chan) 生所需要的結果為(wei) 好，引物濃度偏高會(hui) 引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體(ti) 的機會(hui) 。
樣本采集、存放及運輸：
、樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；
2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可保存，但應避免反複凍融（zui多凍融3次）；
3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
需要自備的器材：
．用儀(yi) 器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀(yi) 、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL、20
µL、200 µL、000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、.5 mL 經焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（0 µL、200 µL、000 µL）、滅菌雙蒸水。
組成及試劑配製:
、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍幹品）： 2瓶，請臨(lin) 用前5分鍾內(nei) 配製。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好後室溫靜置大約0分鍾，同時反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 200 U/L，然後做係列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配製成200 U/L，00 U/L，50 U/L，25 U/L，2.5 U/L，6.25 U/L，3.2 U/L，樣品稀釋液直接作為(wei) 空白孔 0 U/L。如配製00 U/L標準品：取0.3ml （不要少於(yu) 0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：×20ml。
4、 檢測稀釋液A：×0ml。
5、 檢測稀釋液B：×0ml。
操作流程：
. 整個(ge) 檢測過程應嚴(yan) 格按照本說明書(shu) 要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀(yi) 器 、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全櫃，樣本處理在生物安全櫃中進行操作；三個(ge) 區應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為(wei) 避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗後立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。
3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，並應瞬時離心。
5. 試劑盒內(nei) 所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區，並單獨存放。
6. 為(wei) 防止熒光幹擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，並應避免在PCR反應管上進行任何標記。產(chan) 品僅(jin) 供科研使用
7. 儀(yi) 器 擴增相關(guan) 參數應按照本說明書(shu) 相關(guan) 要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI係列熒光定量PCR儀(yi) 參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chan) 品的廢棄物應該進行無害化處理後方可丟(diu) 棄。
注意事項：   

、使用本試劑前請仔細閱讀本說明書(shu) 全文。

2 、操作時應盡量少說話，因口腔中也含有支原體(ti) ，可能引起樣品汙染，而造成假陽性；整個(ge) 檢測過程中，反應體(ti) 係的配製、樣本處理及加樣、PCR擴增應分區域進行，以避免交叉汙染。 

3 、實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應充分融化並混勻（混勻時禁止激烈振蕩，隻需要進行上下倒置多次進行混勻）。

4、 反應管中加好所有的試劑後，應盡快上PCR儀(yi) 進行擴增，以免形成過多的二聚體(ti) 。

5、細胞培養(yang) 物中含有和等抗不會(hui) 影響本品的檢測結果。如果用戶需要進一步提高檢測。