流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書(shu)

、試劑盒簡介貨

主要感染當年草魚種和青魚，死亡率可達80%以上。其它淡水鯉科魚，如鰱魚、鱅魚、鯽魚、鯉魚感染後沒有臨(lin) 床症狀，但可以攜帶病毒到處傳(chuan) 播。該病在水溫高於(yu) 20℃以上時流行, 25～28℃為(wei) 流行高峰。常見的臨(lin) 床症狀為(wei) 眼突出、體(ti) 色發黑，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血。撕開表皮，可見肌肉出現點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發白。病原為(wei) 草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為(wei) 直徑70nm的球形顆粒，有雙層衣殼，無囊膜，含有個(ge) 片段的雙鏈RNA。根據片段長度大小分為(wei) 大（L、L2、L3，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4、M5、M6，大小在2.5～2.0kb）、小（S7、S8、S9、S0、S, 大小在.6～.0kb) 三組。在不同地區存在抗原性、核酸電泳圖譜、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經確定的有二個(ge) 典型的代表株：GCRV-873為(wei) 湖南株，能在CO、CIK等細胞中大量增殖並出現CPE，症狀以內(nei) 髒出血為(wei) 主；GCRV-904為(wei) 湖北株，能在CIK、CO細胞中大量增殖，但不產(chan) 生CPE，症狀以肌肉出血為(wei) 主。在核酸序列上GCRV-904株和GCRV-873株的同源性不到8%。為(wei) 了適應草魚出血病（GCRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴(yan) 格依據SN/T3584-203草血病檢疫技術規範規定的檢測GCRV-904株病毒的引物序列及其循環參數等技術標準，在本公司嚴(yan) 謹的產(chan) 品質量保證體(ti) 係管控下生產(chan) 和質檢。確保本試劑盒滿足標準的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準確、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優(you) 點。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體(ti) 組成參見表 ：

表 ：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體(ti) 積

核酸提取試劑： 核酸裂解液 5ml×2 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

GCRV-904 RT-PCR 反應液

酶混合物陰性對照

GCRV-904 陽性對照 ml× 管

750µL× 管

60µL× 管

ml× 管

ml× 管

（注：核酸提取試劑可使用本公司生產(chan) 的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運輸

3.樣本采集：所用取樣器材必須經高壓滅菌並烘幹。

取新鮮魚類組織髒器（肝、腦、脾、腎）2g 於(yu) 已洗淨、滅菌並烘幹的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻，2 000r/min 離心 0min 取上清轉入無菌離心管中備用。或取有可疑細胞病變的細胞懸液用於(yu) 檢測。

3.2存放：研磨後的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可保存，但應避免反複凍融（zui多凍融 3 次）。

3.3運輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。

4、一步法 RT-PCR 檢測

4.操作方法

4..樣本的處理（在樣本製備區進行）：

4...取 n 個(ge) 滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 為(wei) 被檢樣品與(yu) 陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為(wei) PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4...2每管加入 600 L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 L，一份樣本換用一個(ge) 吸頭，再加入 200 L 氯，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過於(yu) 強烈，以免產(chan) 生乳化層，也可以用手顛倒混勻），於(yu) 4℃ 2 000 r/min 離心 5 min。

4...3取與(yu) 4... 相同數量滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記。吸取 4...2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500L，不能吸出中間層，顛倒混勻。

4...4於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 5 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，沾幹液體(ti) (不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹)；加入 600 L 75％ 乙醇，顛倒洗滌。

4...5於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 0 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，盡量沾幹液體(ti) （不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹）。

4...64 000 r/min 離心 0s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘餘(yu) 液體(ti) 甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸幹，一份樣本換用一個(ge) 吸頭，吸頭不要碰到有沉澱一麵，室溫幹燥 3 min，不能過於(yu) 幹燥，以免 RNA 不溶。

4...7加入 L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備用。提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei) 。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書(shu) 》（貨號：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取核酸】。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei) 。

4.2、試劑準備

4.2.擴增試劑準備（在反應混合物配製區進行）：

從(cong) 試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化後，2 000 r/min 離心5 s。設所需一步法RT-PCR檢測總數為(wei) n，其中n為(wei) 被檢樣品、陽性對照與(yu) 陰性對照的和，每個(ge) 樣品測試反應體(ti) 係配製見下表2。

表 2 每個(ge) 樣品測試反應體(ti) 係配製表

試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶

用量 5 μL .0 μL

根據測試樣品的數量計算好各試劑的使用量，加入到適當體(ti) 積試管中，充分混合均勻，向每個(ge) 一步法RT-PCR管中各分裝5 μL，轉移至樣本處理區。

4.2.2加樣（在樣本處理區進行）：

在各設定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4...7中製備的RNA溶液各0μL，蓋緊管蓋，500 r/min離心30s。

4.3、檢測（在檢測區進行）：

將4.2.2中離心後的PCR管放入PCR檢測儀(yi) 內(nei) ，記錄樣本擺放順序。循環條件設置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min；

第三階段：94 oC/ min, 55 oC/ min，72 oC/ min, 30個(ge) 循環； 第四階段，72 oC/8 min；

第五階段，4 oC 保存。

4.4、瓊脂糖電泳

用電泳緩衝(chong) 液製備.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩衝(chong) 液剛好淹沒膠麵。將0μL樣品PCR擴增產(chan) 物和相應電泳上樣緩衝(chong) 液（Loading Buffer）按比例混勻後加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀(yi) 的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝並記錄。

5、結果判定

5.一步法RT-PCR後陽性對照出現一條320bp的DNA段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2待測樣品在相應 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。

6、相關(guan) 技術信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’