說明書(shu)

產(chan) 品僅(jin) 用於(yu) 科研產(chan) 品名稱:包納米蟲（Bona）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）

規格:48T 0.PCR管/48T 0.2PCR管
技術服務內(nei) 容：

實驗步驟包括RNA提取、反轉錄、PCR和瓊脂糖凝膠電泳，以軟件分析電泳條帶的灰度值（IOD值），通過與(yu) 內(nei) 參基因的灰度值比較，判斷目的mRNA的相對表達量。
 

使用方法:

一、樣品 RNA 的製備

、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chan) 的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉錄）反應合成 cDNA

. 按下表配製 RT 反應體(ti) 係（20 μL 體(ti) 係）

2. 70℃保溫 5 分鍾變性模板後立即冰浴。

3. 嚴(yan) 格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉錄酶（含 RI），

反應終體(ti) 積為(wei) 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鍾。此步為(wei) RT 反應。

5. 70℃保溫 0 分鍾以終止反應，然後放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為(wei) PCR 模板使用，丌需要純化。

三、操作方法
 
樣本的處理（在樣本製備區進行）：
.、取 n 個(ge) 滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 為(wei) 被檢樣品與(yu) 陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為(wei) PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
.2、每管加入 600 L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 L，一份樣本換用一個(ge) 吸頭，再加入 200 L 氯，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過於(yu) 強烈，以免產(chan) 生乳化層，也可以用手顛倒混勻），於(yu) 4℃ 2 000 r/min 離心 5 min。
.3、取與(yu) . 相同數量滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記。吸取.2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500L，不能吸出中間層，顛倒混勻。
.4、於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 5 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，沾幹液體(ti) (不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹)；加入 600 L 75％ 乙醇，顛倒洗滌。.5、於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 0 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，盡量沾幹液體(ti) （不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹）。
.6、4 000 r/min 離心 0s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘餘(yu) 液體(ti) 甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸幹，一份樣本換用一個(ge) 吸頭，吸頭不要碰到有沉澱一麵，室溫幹燥 3 min，不能過於(yu) 幹燥，以免 RNA 不溶。
.7、加入 L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備用。提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei) 。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書(shu) 》（貨號：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei)
實驗注意事項：

）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存於(yu) 液氮或幹冰，也可以保存於(yu) Trizol液中。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩(liang) 類，探針類是利用與(yu) 靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chan) 物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。