鯉春病毒(SVCV)核酸檢測試劑盒說明書(shu)

產(chan) 品名稱       48T

組成及試劑配製:

、酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍幹品）： 2瓶，請臨(lin) 用前5分鍾內(nei) 配製。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好後室溫靜置大約0分鍾，同時反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 200 U/L，然後做係列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配製成200 U/L，00 U/L，50 U/L，25 U/L，2.5 U/L，6.25 U/L，3.2 U/L，樣品稀釋液直接作為(wei) 空白孔 0 U/L。如配製00 U/L標準品：取0.3ml （不要少於(yu) 0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：×20ml。

4、 檢測稀釋液A：×0ml。

5、 檢測稀釋液B：×0ml。

【標本要求】

人體(ti) 鼻腔或咽部分泌物:用無菌撚拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置入無菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊後，密閉送檢。標本可立即用於(yu) 檢測，也可保存於(yu) -20℃待測。

【檢驗方法】

.標本、對照品的核酸裂解處理

用商品化（取得醫療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標本，具體(ti) 操作參見該試劑盒說明書(shu) 。

或用Trizol法提取，方法如下：取00?l樣品置於(yu) .5ml 離心管中，加入300?l裂解液（Trizol），再加入00， 混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻5次； 3000rpm離心5min， 吸取上層液體(ti) ，加入等體(ti) 積異丙醇，顛倒混勻室溫靜置0min， 3000rpm離心0min，輕輕倒去上清；加入700?l 75%乙醇，顛倒洗滌，3000rpm離心5min，輕輕倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，棄盡液體(ti) 或4000rpm離心5sec，將管壁上的殘餘(yu) 液體(ti) 甩到管底部，用微量加樣器盡量吸幹液體(ti) ，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA。

2.試劑配製

取n×9?l H7N9核酸熒光PCR檢測混合液與(yu) n×?l RT-PCR酶（n為(wei) 反應管數）,振蕩混勻數秒, 3000rpm離心數秒。

3.加樣取上述混合液20?l置於(yu) PCR管中，然後將樣品核酸提取液、DEPC-H2O、陽性對照品各5?l分別加入PCR管中，蓋好管蓋，立即進行PCR擴增反應。

4. PCR擴增反應管置於(yu) 定量熒光PCR儀(yi) 上，循環參數設置：

45℃×0min; 95℃×5min;循環一次，再按95℃×5sec→60℃×60sec，循環45次;單點熒光檢測在60℃，反應體(ti) 係為(wei) 25?l。

熒光通道檢測選擇：選用FAM通道。

樣本采集、存放及運輸：

、樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可保存，但應避免反複凍融（zui多凍融3次）；

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。

反應五要素:

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關(guan) 鍵，PCR 產(chan) 物的特異性取決(jue) 於(yu) 引物與(yu) 模板DNA互補的程度。理論上，隻要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體(ti) 外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 5-30bp，常用為(wei) 20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為(wei) 宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為(wei) 宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個(ge) 以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nei) 部出現二級結構，避免兩(liang) 條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(hui) 形成引物二聚體(ti) ，產(chan) 生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個(ge) 堿基，應嚴(yan) 格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與(yu) 核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以低引物量產(chan) 生所需要的結果為(wei) 好，引物濃度偏高會(hui) 引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體(ti) 的機會(hui) 。