實驗原理
本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心酶標免疫分析法測定標本中Smad7水平。用純化的抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入Smad7抗原、化的抗大鼠Smad7抗體(ti) 、HRP標記的親(qin) 和素，經過*洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Smad7呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 
試劑盒組成及試劑配製 
酶聯板：一塊（96孔） 
標準品（凍幹品）：2瓶，每瓶臨(lin) 用前以樣品稀釋液稀釋至ml，蓋好後靜置0分鍾以上，然後反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 2000 pg/mL，做係列倍比稀釋後，分別稀釋成2000 pg/mL，6000 pg/mL ，300 pg/mL，500 pg/mL，750 pg/mL，375 pg/mL，87 pg/mL，其原液直接作為(wei) zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為(wei) 標準濃度0 pg/mL，臨(lin) 用前5分鍾內(nei) 配製。
如配製5000 pg/mL標準品：取0.5ml 0000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。
樣品稀釋液：×20ml/瓶。
檢測稀釋液A：×0ml/瓶。
檢測稀釋液B：×0ml/瓶。
檢測溶液A：×20ul/瓶（：00）臨(lin) 用前以檢測稀釋液A ：00稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔00ul），實際配製時應多配製0.-0.2ml。如ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製。
檢測溶液B：×20ul/瓶（：00）臨(lin) 用前以檢測稀釋液B：00稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
底物溶液：×0ml/瓶。 
濃洗滌液：×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
終止液：×0ml/瓶（2N H2SO4）。 
標本的采集及保存 
．細胞培養(yang) 物上清：請離心後收集上清，並將標本保存於(yu) -20℃，且應避免反複凍融。
2．血清：標本請於(yu) 室溫放置2小時或4℃過夜後於(yu) 000 x g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為(wei) 抗凝劑，標本采集後30分鍾內(nei) 於(yu) 2 - 8° C 000 x g離心5分鍾，或將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融。
注：標本溶血會(hui) 影響zui後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，應在試管中將樣品用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測範圍。
加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液00ul，餘(yu) 孔分別加標準品或待測樣品00ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應20分鍾。
為(wei) 保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
棄去液體(ti) ，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 00ul（取ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製），37℃,60分鍾。
溫育60分鍾後，棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板3次，每次浸泡-2分鍾，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內(nei) 液體(ti) 拍幹）。 
每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 00ul，37℃，60分鍾。
溫育60分鍾後，棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板5次，每次浸泡-2分鍾，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內(nei) 液體(ti) 拍幹）。
依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鍾內(nei) ）（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭(lan) 色，後3-4孔梯度不明顯）。
依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與(yu) 底物液的加入順序相同。為(wei) 了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應盡快加入終止液。
用酶聯儀(yi) 在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液後5分鍾以內(nei) 進行檢測。

注：
． 每次實驗留一孔作為(wei) 空白調零孔，該孔不加任何試劑，隻是zui後加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 
2．為(wei) 防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於(yu) 鋪有濕布的密閉盒內(nei) ，酶標板加上蓋或覆膜。
3. 未使用完的酶標板或者試劑，請於(yu) 2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，不要一次用完。請勿重複使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
4. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nei) 的液體(ti) ；在實驗台上鋪墊幾層吸水
紙，酶標板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩衝(chong) 液至少0.3ml注入孔內(nei) ，浸泡-2分鍾，根據需
要，重複此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。

特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠Smad7，且與(yu) 其它相關(guan) 蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為(wei) 橫坐標（對數坐標），OD值為(wei) 縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。 
注意事項
洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
一次加樣時間控製在5分鍾內(nei) ，如標本數量多，使用排槍加樣。
請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。
如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請zui後乘以稀釋倍數。
5．在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。
6．底物請避光保存。