、 簡介 
貨號：HB-94-2 
為(wei) 了適應貝類諾沃克病毒快速檢測和疫病研究的需要，本公司根據 2005 年國家質量監督管理總
局發布的出入境檢驗檢疫行業(ye) 標準(SN/T 635-2005)中的的引物和探針序列，經多次實驗及係
統優(you) 化，開發生產(chan) 了本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡
單、應用廣泛和高通量檢測等特點及優(you) 點。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體(ti) 組成參見表 ：
表 ：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體(ti) 積 
核酸提取試劑： 核酸裂解液 5ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
諾沃克 GII 型熒光 RT-PCR 反應液
酶混合物
陰性對照
諾沃克 GII 型 陽性對照
 ml× 管
750µL× 管
60µL× 管
ml× 管
ml× 管
（注：核酸提取試劑可使用本公司生產(chan) 的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、 樣本采集,存放及運輸 
3. 樣本采集：所用取樣器材必須經高壓滅菌並烘幹。
取貝類中腸腺組織約 5 g，加入 35 mL 的緩衝(chong) 液高速勻漿，37℃孵育 30 min，4℃ 0,000g
離心 30 min。取上清，加入等體(ti) 積 PEG8000，反複顛倒混勻，冰上放置 h，4℃ 0,000g 離心 5 min，
棄上清。保留沉澱備用。
3.2 存放：樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可保存，但應避免反複凍
融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、 熒光 RT-PCR 檢測 
4. 操作方法 
4.. 樣本的處理（在樣本製備區進行）：
4... 取 n 個(ge) 滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 為(wei) 被檢樣品與(yu) 陰性對照的和（陽性對照、陰性
對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為(wei) PCR 檢測的模板，無需
提取核酸)
4...2 每管加入 600 µL 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 µL，一份樣本換用一個(ge) 吸
頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過於(yu) 強烈，以免產(chan) 生乳化層，也可以用
手顛倒混勻），於(yu) 4℃ 2 000 r/min 離心 5 min。
4...3 取與(yu) 4... 相同數量滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 異丙醇（-20℃預冷），
做標記。吸取 4...2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500µL，不能吸
出中間層，顛倒混勻。
4...4 於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 5 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小
心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，沾幹液體(ti) (不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹)；加入 600 µL 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4...5 於(yu) 4 ℃、2 000 r/min 離心 0 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小
心倒去上清，倒置於(yu) 吸水紙上，盡量沾幹液體(ti) （不同樣品須在吸水紙不同地方沾幹）。
4...6 4 000 r/min 離心 0s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘餘(yu)
液體(ti) 甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸幹，一份樣本換用一個(ge) 吸頭，吸頭不要
碰到有沉澱一麵，室溫幹燥 3 min，不能過於(yu) 幹燥，以免 RNA 不溶。
4...7 加入 µL DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備
用。提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei) 。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書(shu) 》（貨號：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nei) 進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nei) 。 
4..2 檢測
4..2. 擴增試劑準備（在反應混合物配製區進行）：
從(cong) 試劑盒中取出相應的熒光 RT-PCR 反應液、酶混合物，在室溫下融化後，2000 r/min 離心 5 s。
設所需熒光 RT-PCR 檢測總數為(wei) n，其中 n 為(wei) 被檢樣品、陽性對照與(yu) 陰性對照的和，每個(ge) 樣品測試反
應體(ti) 係配製見表 2：
表 2 每個(ge) 樣品測試反應體(ti) 係配製表
試劑 RT-PCR 反應液 酶混合物
用量 5 μL .0 μL
根據測試樣品的數量計算好各試劑的使用量，加入到適當體(ti) 積試管中，充分混合均勻，向每個(ge)
熒光RT-PCR管中各分裝6 µL，轉移至樣本處理區。
4..2.2 加樣（樣本處理區進行）：
在各設定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4...7中製備的RNA溶液各0 µL，蓋緊
管蓋，500 r/min離心30 s。
4..2.3 熒光 RT-PCR 檢測（在檢測區進行）：
將4..2.2中離心後的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀(yi) 內(nei) ，記錄樣本擺放順序。
循環條件設置：
*階段，反轉錄48
o
C /45 min，50 o
C /2 min
第二階段，預變性95 o
C/0 min；
第三階段，95 o
C/5s，60 o
C/60s，40個(ge) 循環，在第三階段每次循環的60 o
C退火延伸時收集熒光。
試驗檢測結束後，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。
4.2 結果判定 
4.2. 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據儀(yi) 器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴增曲線的zui高點為(wei) 準。
4.2.2 質控標準
4.2.2. 陰性對照無 Ct 值或無擴增曲線。
4.2.2.2 陽性對照的 Ct 值應<25.0，並出現典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為(wei) 無效。
4.2.3 結果描述及判定
4.2.3. 陰性
無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無諾沃克病毒GII型核酸。
4.2.3.2 陽性
Ct值≤30，且出現典型的擴增曲線，示樣品中存在諾沃克病毒GII型核酸。
4.2.3.3 有效原則
Ct值>30的樣本建議重做。重做結果無數值者為(wei) 陰性，否則為(wei) 陽性。
5、 相關(guan) 技術信息（引物和探針序列） 
F：CARGARBCNATGTTYGRTGGATGAG
R：TCGACGCCATCTTCATTCACA
Probe：FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRA