埃博拉病毒（EBOV）核酸檢測試劑盒檢測常見問題

檢測常見問題的常見原因

. cDNA產(chan) 量的很低可能的原因：

) RNA模板質量低

2) 對mRNA濃度估計過高

3)反應體(ti) 係中存在反轉錄酶抑製劑或反轉錄酶量不足

4)同位素磷32過期

5)反應體(ti) 積過大，不應超過50μl

2. 擴增產(chan) 物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

)常見的原因在於(yu) 您的反應體(ti) 係是PCR的反應體(ti) 係而不是RT-PCR的反應體(ti) 係

3) 與(yu) 反應起始時RNA的總量及純度有關(guan)

4) 建議在試驗中加入對照RNA

5) 一鏈的反應產(chan) 物在進行PCR擴增時，在總的反應體(ti) 係中的含量不要超過/0

6) 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用於(yu) 一鏈合成。由於(yu) RNA模板存在二級結構，如環狀結果，有可能導致GSP無法與(yu) 模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從(cong) 此引物進行有效延伸。

7) 目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決(jue) ：

a. 將一鏈的反應溫度提高至50℃。

b. 使用隨機六聚體(ti) 代替Oligo(dT)進行一鏈反應。

3. 產(chan) 生非特異性條帶

)用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA汙染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2)在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chan) 生非特異性結果。在低於(yu) 引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chan) 生。

3)由於(yu) mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產(chan) 生不同的RT-PCR結果。

4. 產(chan) 生彌散（smear）條帶

)在PCR反應體(ti) 係中一鏈產(chan) 物的含量過高

2)減少引物的用量

3)優(you) 化PCR反應條件/減少PCR的循環次數

4)在用DNase處理被DNA汙染的RNA樣品時，其產(chan) 生的寡核苷酸片段會(hui) 產(chan) 生非特異性擴增，一般會(hui) 顯示為(wei) 彌散背景。

5. 產(chan) 生大分子量的彌散條帶

)大多數情況下是由於(yu) 退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產(chan) 生的

2)對於(yu) 長片段的PCR，建議將反應體(ti) 係中cDNA的濃度稀釋至:0（或:00-:200）

6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果詳細解析關(guan) 於(yu) Elisa試劑盒的儲(chu) 存於(yu) 有效期多久