國產hth体育下载地址凝膠過濾實驗方法

國產(chan) hth体育下载地址凡能催化同一種化學反應，但其分子結構和帶電性質不同的一組酶稱同工酶（isoenzyme）。同工酶譜的差異是基因表達的差異造成的，所以在研究植物基因調控與(yu) 生長發育及其與(yu) 環境條件的關(guan) 係以及許多生理生化和遺傳(chuan) 問題時，常常要分析同工酶譜的差異。因此，同工酶研究在理論和實踐中都有非常重要的意義(yi) 。

一、原理

聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而成，具有三維網狀結構，其網孔大小可由凝膠濃度和交聯度加以調節。凝膠電泳兼有電荷效應和分子篩效應。被分離物質由於(yu) 所載電荷數量、分子大小和形狀的差異，因此在電泳時產(chan) 生不同的泳動速率而相互分離。利用特異性的顏色反應使待測酶著色，這樣就可在凝膠中展現出酶譜。過氧化物酶是植物體(ti) 內(nei) 常見的氧化酶。植物體(ti) 內(nei) 許多生理代謝過程常與(yu) 它的活性及其同工酶的種類有關(guan) 。利用過氧化物酶能催化H2O2把聯苯胺氧化成藍色或棕褐色產(chan) 物的原理，將經過電泳後的凝膠置於(yu) 有H2O2及聯苯胺的溶液染色，出現藍色或棕褐色部位即為(wei) 過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構成過氧化物酶同工酶譜。本實驗利用連續的盤狀凝膠電泳，采用Tris－Gly緩衝(chong) 係統來分離陰離子過氧化物酶同工酶。

二、材料、儀(yi) 器設備及試劑

（一）材料：小麥芽

（二）儀(yi) 器設備： .穩流穩壓電泳儀(yi) ；2.冷凍離心機及離心管；3.成套電泳槽（圓盤型）；4.pH試紙；5.其它常規用具。

（三）試劑： .分離膠緩衝(chong) 液（pH8.9）：mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加水定容至00ml。2.分離膠貯液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解並定容至00ml，過濾後使用。3.過硫酸銨溶液：過硫酸銨0.2g，加水定容至00ml製膠時現配現用）。4.濃縮膠緩衝(chong) 液：mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，調pH6.7，並定容至00ml。5.濃縮膠貯備液：丙烯酰胺0g，甲叉雙丙烯酰胺2.5g加水定容到00ml，使用前過濾。6.電極緩衝(chong) 液：Tris 6.0g，Gly 28.8g，用水定容至000ml（pH8.3），用前稀釋0倍。7.四甲基乙二胺（TEMED）。8.0.%的溴酚藍水溶液。9.聯苯胺染色母液：聯苯胺g＋冰醋酸8ml＋H2O2ml溶解貯於(yu) 棕色瓶中。

三、國產(chan) hth体育下载地址實驗步驟

.安裝電泳槽

2.凝膠的配製

3.過氧化物酶的提取 稱取g待測植物鮮樣置於(yu) 冰浴上的研缽內(nei) ，加入mlH2O或0.05mol/L Tris－HCl緩衝(chong) 液（pH6，8）研成勻漿，轉入離心管，再用2ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下並全部轉入離心管，3500rpm離心5～20min，其上清液即為(wei) 酶的提取液，供電泳分析用。

4.點樣：用微量注射器吸取上清液，每管加樣50μl，再分別加入40%蔗糖溶液5μl，之後再用注射器將電極緩衝(chong) 液慢慢加入每支膠管至浸沒頂部為(wei) 止.zui後向上、下電泳槽倒入電極緩衝(chong) 液（上槽必須淹沒管頂，下槽液要能浸泡著凝膠管），zui後在上槽液中滴入～2滴溴酚藍溶液。

5.電泳：將電泳槽放至低溫處，在4℃左右，或接通電泳槽水冷卻係統按上“一”下“＋”接好導線，通電，電泳開始電流應低，每管mA，0min後，再加大電流，使每管達到2～3mA，當溴酚藍指示劑達到距管底約cm處時，切斷電流，停止電泳。

6.剝膠：電泳完畢，將電泳槽取出，倒去緩衝(chong) 液，取下凝膠管，放入培養(yang) 皿中。用一個(ge) 帶有長針頭的注射器，吸滿水，將針頭沿管壁插入，同時慢慢地將注射器中的水推出，並不斷轉動凝膠管，將凝膠管擠脫出來，也可用洗耳球擠壓。

7.染色：取0.5ml聯苯胺母液＋H2O 9.3ml＋0.2ml3%H2O2，混勻後倒入盛有凝膠條的培養(yang) 皿。此時可以看到膠條上出現藍色或棕褐色環，即過氧化物酶帶，約十min後用自來水衝(chong) 洗，這時藍色帶也慢慢變成棕褐色。

8.記錄酶譜，並計算各同工酶的遷移率。
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