進口hth体育下载地址操作如何讓ELISA係統更穩定

進口hth体育下载地址檢測係統可謂是免疫學反應應用到科研生產(chan) 中zui為(wei) 靈敏的技術手段。可是在新老手操作過程中總是會(hui) 出現或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時就麵臨(lin) 很多困難，雖然有師兄師姐鋪路，但還是常常做得一塌糊塗，比如說花板，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低,自己也為(wei) 此苦惱過很長一段時間，隨著自己技術水平得提高，或多或少地也掌握了ELISA體(ti) 係的脾氣，也是熟能生巧吧，現在做方陣，做ELISA已是輕車熟路了，以前檢測一種抗體(ti) 用整整一下午還算得暈暈的，現在給我十個(ge) 八個(ge) 的從(cong) 包被到顯色，一個(ge) 工作日基本搞定。下麵就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA的經驗總結:
 、包被原的性質很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guan) 係到你做出的抗體(ti) 可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yan) 格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(ge) 道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對於(yu) 和脂類物質或小分子物質我們(men) 要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:①親(qin) 和素:先親(qin) 和素先包被載體(ti) ，加入化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於(yu) 各種抗原物質的定量測定。②脂類物質:可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解後加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱guo ye或冷風吹幹，待酒精揮發後，讓脂質自然幹固在固相表麵。③小分子必須依靠和大的蛋白載體(ti) 偶聯後才能固定在固相載體(ti) 上。
 2、進口hth体育下载地址包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩衝(chong) 液。但有時由於(yu) 試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩衝(chong) 溶液來包。應注意以下原理：由於(yu) 蛋白質與(yu) 聚苯乙烯固相載體(ti) 是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與(yu) 固相載體(ti) 表麵的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體(ti) 表麵。具體(ti) 的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下zui終可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩衝(chong) 液，還有pH7.2的磷酸鹽緩衝(chong) 液和pH7-8的Tris-HCL緩衝(chong) 液等等。
 3、封閉：繼包被之後用高濃度的無關(guan) 蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guan) 的蛋白質充填這些空隙，從(cong) 而排斥ELISA後的步驟中幹擾物質的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;0%的小牛血清或%明膠;脫脂奶粉，比較價(jia) 廉，可以高濃度使用(5%-0%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為(wei) 了排除相似蛋白幹擾)和酪蛋白等等。但zui終選用什麽(me) ，要依據試驗具體(ti) 來實踐。
 4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術。因為(wei) 聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，為(wei) 達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中遊離的物質，以及非特異性地吸附的幹擾物質，在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。所以在洗板時會(hui) 有一定誤差，人為(wei) 因素很大(當然有條件的用洗板機除外)，洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA係統可是不小的影響。
 5、加抗體(ti) 標本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著色淺。
 6、顯色:顯色係統又很多，我們(men) 一開始做的時候，要選擇適宜的顯色係統。注意顯色係統酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。
 7、進口hth体育下载地址每次做盡量要把陰陽空三個(ge) 對照做好，如出現問題也好分析。