酵母雙雜交實驗常見問題分析及處理方法

酵母雙雜交實驗常見問題分析及處理方法

在某些情況下，國產(chan) hth体育下载地址在液體(ti) 培養(yang) 基中培養(yang) 不好的菌珠可以在固體(ti) 培養(yang) 基上生長得很好。首先重懸克隆於(yu) ml的SD/–Trp，接著將重懸液平鋪於(yu) 5 個(ge) 00-mm的SD/–Trp平板，在30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，並收集到一管中，這樣就可以使用這個(ge) 細胞重懸液進行正常的雜交反應。

如果誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達，該如何處理?

該蛋白很可能有轉錄激活域，是個(ge) 轉錄因子。可以通過基因重組切掉轉錄激活域，然後重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

轉化效率太低怎麽(me) 辦?

可以采用以下方法解決(jue) ：

)國產(chan) hth体育下载地址檢測一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。

2)DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。

3)不適當的培養(yang) 基，重新配製培養(yang) 基，並做對照轉化。

4)檢測pGBT9對照載體(ti) 的轉化效率，放置於(yu) SD/–Trp平板上，轉化效率應該在 x05 colonies/mg DNA以上。

雜交效率不高，該如何處理?

在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體(ti) 培養(yang) 過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養(yang) ，經過離心和重懸後，再使用血球計對細胞進行計數。密度應該在 x09/ml。

一個(ge) 甚至兩(liang) 個(ge) 融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體(ti) 。國產(chan) hth体育下载地址也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。