熒光原位雜交特點和應用

熒光原位雜交特點和應用

原位雜交hth体育下载地址價(jia) 格的探針按標記分子類型分為(wei) 放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優(you) 勢在於(yu) 對製備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記係統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為(wei) 非放射性檢測體(ti) 係，有以下特點。

熒光原位雜交優(you) 點:、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定，一次標記後可在兩(liang) 年內(nei) 使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在kb的DNA序列，其靈敏度與(yu) 放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個(ge) 核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體(ti) 數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體(ti) DNA的結構。

熒光原位雜交缺點：不能達到00%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

熒光原位雜交技術zui初用於(yu) 中期染色體(ti) 。從(cong) 正在分化的細胞核中製備的這種染色體(ti) 是高度凝縮的，每條染色體(ti) 都具有可識別的形態，它們(men) 染色後將顯現出特征性的著絲(si) 粒位置及染色帶型。在處理中期染色體(ti) 時，hth体育下载地址價(jia) 格通過測定FISH所獲得熒光信號相對於(yu) 染色體(ti) 短臂末端的位置(FLpter值)來進行作圖。使用中期染色體(ti) 的不足之處在於(yu) ，由於(yu) 它的高度凝縮的性質，隻能進行低分辨率作圖，兩(liang) 個(ge) 標記至少分隔Mb才能作為(wei) 分開的雜交信號被分辨出來(Trask et al.，99)。這種分辨率不足以構建有交往的染色體(ti) 圖譜。故此中期染色體(ti) FISH主要用於(yu) 確定新標記在染色體(ti) 上的大概位置，為(wei) 其他更精細的作圖方法做準備。 一直以來，這些“其他方法”並不包括任一種FISH，但995年後，一係列高分辨率的FISH技術已發展起來。這些技術通過改變待研究的染色體(ti) 製備的性質而達到較高的分辨率。中期染色體(ti) 對於(yu) 精細作圖來說凝縮度太高，因而我們(men) 需要選用較為(wei) 伸展的染色體(ti) 。有兩(liang) 種途徑可以滿足這一要求(Heiskanen et al.，996)： 機械伸展的染色體(ti) (mechanically stretched chromosome)通過改變從(cong) 中期細胞核中分享染色體(ti) 的方法而獲得。離心產(chan) 生剪切力可將染色體(ti) 伸展到正常長度20倍。每條染色體(ti) 仍可識別，而FISH信號作圖方法與(yu) 通常處理的中期染色體(ti) 相同，這樣，分辨率可明顯提高，能夠區分出相隔200~300kb的標記。 非中期染色體(ti) (non-metaphase chromosome)染色體(ti) 僅(jin) 在中期高度凝縮，而在細胞周期的其他階段保持天然未包裝狀態，有研究者曾利用前期細胞核，此時染色體(ti) 凝縮程度足以區分出單個(ge) 染色體(ti) 。實際應用中，這種方法並無優(you) 於(yu) 機械伸展的染色體(ti) 之處。相比之下分裂間期(interphase)的染色體(ti) 更為(wei) 有用，因為(wei) 分裂間期(再次細胞核分裂之間)的染色體(ti) 包裝程度zui低。使用分裂間期的染色體(ti) ，分辨率有可能達到25kb以下，但染色體(ti) 形態特征消失，推動了定位探針位置所需的外部參照點。因此，該技術可在已獲得染色體(ti) 粗略圖譜後使用，通常作為(wei) 確定染色體(ti) 一段小區域內(nei) 一係列標記物順序的方法。 間期染色體(ti) 含有去組裝的全部的細胞DNA分子。為(wei) 了進一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體(ti) ，而使用純化的DNA。這種方法叫做纖維-FISH(fiber-FISH)，hth体育下载地址價(jia) 格利用凝膠拉伸或分子梳理技術製備DNA，可以分辨間距小於(yu) 0kb的標記。