如何解決免疫組化染色過程中的問題

如何解決(jue) 免疫組化染色過程中的問題

一、“雜音”染色片
     免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會(hui) 遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為(wei) “雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chan) 生的原因也多種多樣，為(wei) 了便於(yu) 說明，筆者將其歸納為(wei) 下麵幾種。
    、 全片著色
    全片著色是指整個(ge) 切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：
     （）、抗體(ti) 濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決(jue) 辦法是，每次使用新抗體(ti) 前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體(ti) 個(ge) 體(ti) 化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體(ti) 也應如此，不能隻簡單的按說明書(shu) 進行染色。
    （2）、抗體(ti) 孵育時間過長或溫度較高：解決(jue) 辦法是，嚴(yan) 格執行操作規程，隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳(chuan) 統的小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。
    （3）、DAB變質和顯色時間太長：DAB現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長，因為(wei) 在沒有酶的情況下，過氧化氫也會(hui) 遊離出氧原子與(yu) DAB產(chan) 生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體(ti) 顯色時進行監控，避免顯色時間過長。
    （4）、組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體(ti) 、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決(jue) 的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體(ti) 流失，也能提高操作速度。
    （5）、切片在緩衝(chong) 液或修複液中浸泡時間太長（大於(yu) 24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第二天加抗體(ti) 進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修複液的容器放在4ºC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(hui) 出現背景著色，因此，不可存放時間太長。（6）、一抗變質、質量差的多克隆抗體(ti) ：注意抗體(ti) 的有效期，過期的抗體(ti) 要麽(me) 不顯色要麽(me) 背景著色。用新買(mai) 的抗體(ti) 時設立陽性對照和用使用過的抗體(ti) 作比較。
    2、 切片邊緣著色
    切片邊緣著色也是一種常見的現象，這種現象稱為(wei) 邊緣效應。產(chan) 生的原因：（）、組織邊緣與(yu) 玻片粘貼不牢，邊緣組織鬆脫漂浮在液體(ti) 中，每次清洗不易將組織下麵試劑洗盡所致。解決(jue) 辦法：製備的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚於(yu) 4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）、切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高而致染色深。解決(jue) 辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2 mm。用DAKO筆畫圈時，為(wei) 了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4 mm。
    3、“陰陽臉”著色
    指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩(liang) 種染色結果。其成因是試劑僅(jin) 覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑後未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應該在加完試劑後，仔細看一遍，是否有的組織未被試劑*覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾(qing) 斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但後來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對於(yu) 這種問題，隻要留心或想到了很容易發現，也很容易解決(jue) 。有時，用DAKO（或PAP）筆在組織周圍畫圈時，劃線太靠近或畫到了組織上，由於(yu) 筆油的力學原理，試劑不能達到靠近劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，隻是不著色區域是圓形，由於(yu) 氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決(jue) 辦法是滴加試劑時手法要輕，有氣泡時用牙簽捅破。
    4、 灶片狀著色
    切片中著色區東(dong) 一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現這種問題的原因有：（）、裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入後不易洗盡，顯色過深所致。解決(jue) 辦法是，漂片盒裏的氣泡應去盡，晾片熱台不能平放，應有45度左右的斜度，利於(yu) 水流走和蒸發。（2）、壞死組織灶，免疫組織壞死後細胞破壞、酶的釋放、蛋白遊離、分解，複雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與(yu) 一抗或/和二抗結合導致zui終著色。解決(jue) 辦法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。（3）、製作APES膠片時，膠的濃度太高，幹燥後在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決(jue) 辦法是按照標準的製備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水衝(chong) 洗玻片小時、蒸餾水洗玻片分鍾、丙酮浸泡玻片5秒鍾後空氣幹燥（室溫）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分鍾、玻片過一下丙酮（-2秒鍾）、玻片過一下蒸餾水（-2秒鍾）、37°C過夜幹燥、室溫儲(chu) 存備用。如果製片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可適當加入一些丙酮。
    5、 間質著色
    著色部位主要在間質，間質著色的原因很多，如抗體(ti) 與(yu) 組織中的蛋白質因蛋白疏水基團相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的清封閉這一步就是為(wei) 了避免非特異型的結合。又如清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質，很容易與(yu) 抗體(ti) 結合，造成間質著色，特別是lambda和kappa染色時。當甲狀腺膠質外溢到組織間質時，做甲狀腺球蛋白染色也會(hui) 出現間質著色。抗體(ti) 不純或抗體(ti) 被汙染也可出現間質著色，我們(men) 曾遇到CD20抗體(ti) 不純，除了染上B細胞外還染上了間質。
    6、 細胞漿著色
    胞漿著色是所有“雜音”染色中有欺騙性的著色，著色區局限在細胞內(nei) ，間質無著色，看上去與(yu) 真實的免疫反應著色幾乎一樣，很難區別。胞漿裏含有較多的蛋白質，因此，很多非特異性的染色除了見於(yu) 間質也可以出現在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過清封閉解決(jue) 。還有因內(nei) 源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞、單核細胞）、過氧化氫酶（肝、腎），這些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fc片斷而出現胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過形態學辨認出巨噬細胞而引起重視。內(nei) 源性的著色有欺騙性，因為(wei) 它廣泛的存在於(yu) 組織細胞中，我們(men) 研究結果顯示：冰凍組織中存在內(nei) 源性，經福馬林固定石蠟包埋後被封閉，加熱抗原修複後造成內(nei) 源性暴露，內(nei) 源性暴露的強度在不同的組織有所不同，免疫從(cong) 弱陽性（+）到強陽性（+++），內(nei) 源性在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在於(yu) 胞漿中，內(nei) 源性廣泛存在於(yu) 上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nei) 源性不僅(jin) 存在人體(ti) 組織也存在大鼠組織，內(nei) 源性暴露的強弱與(yu) 修複液有關(guan) ，其強度增加依次為(wei) ：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修複暴露的內(nei) 源性可被雞蛋清封閉，非檢測係統Polymer兩(liang) 步法（EliVision、EnVision）可避免幹擾。
    7、 細胞核著色
    不適當的組織處理可以出現細胞核著色，如組織在二甲苯裏浸泡時間太長（如從(cong) 星期五浸泡到下星期一）、緩衝(chong) 液中浸泡時間太長、組織變幹、微波修複液的pH值和修複時間不當或修複過程中修複液留下得太少，未沒過組織等。解決(jue) 辦法是嚴(yan) 格按照操作常規進行工作。

二、 無色片
    染色結束後，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩(liang) 種可能：、真陰性結果：整個(ge) 染色過程沒有出現問題，組織或細胞確實不表達與(yu) 抗體(ti) 相關(guan) 的抗原。2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。假陰性結果又可分為(wei) 兩(liang) 種情況：（）、切片中根本就不包含所預期檢查的組織或細胞。出現這種情況，要麽(me) 是病理醫生選擇錯了切片或抗體(ti) 選錯了，要麽(me) 是技術員選錯了蠟塊。獲得正確的切片進行染色是獲得正確結果的前提。由此表明：製作出合格的免疫組化切片不僅(jin) 僅(jin) 是技術員的事，病理醫生也起著*的作用。（2）、染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修複，有的組織必須經過抗原修複才能檢測抗原表達；或選用了隻能用於(yu) 冰凍組織而不能用於(yu) 石蠟包埋組織的抗體(ti) ；或一抗失效，雖然抗體(ti) 失效在理論上是一個(ge) 逐漸的過程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體(ti) 不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見於(yu) 染色過程中漏掉了某一環節，如忘記加二抗或三抗，或用了兩(liang) 次二抗而缺少了三抗，或配製DAB時少了過氧化氫。為(wei) 了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配製好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現了，證明三抗和DAB的配製過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗DAB或DAB的配製過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們(men) 查找出現問題可能的原因。
    解決(jue) 陰性染色的問題非常簡單，就是設立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為(wei) 陰性，便是真實的陰性，說明組織或細胞沒有相應的抗原表達。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個(ge) 或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應一一尋找原因。陽性對照包括兩(liang) 種，一種稱為(wei) “自身對照”或“內(nei) 部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3都應該有表達。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細胞都在同一張切片中，都處於(yu) 相同的試驗條件下，結果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時選擇既變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利於(yu) 對比。另一種稱為(wei) “外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guan) 的抗原，如果病變出現陽性反應結果，尚能提示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術問題。因此，應另外設立一個(ge) 已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為(wei) “外部對照”。在實際工作中需要設立外部對照的情況很多，如果每一種抗體(ti) 都要選不同的陽性對照，工作量會(hui) 很大。為(wei) 了解決(jue) 這個(ge) 問題，目前國內(nei) 外有單位將多種不同組織集成在一起，製成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續切片儲(chu) 備待用，需要時取出一張便可作為(wei) 陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為(wei) 陽性對照，因為(wei) 與(yu) 人體(ti) 其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質、神經、管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體(ti) 。
    設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對照，如果沒有，就應告訴技術員采用陽性對照。因此，病理醫生在免疫組化中的作用是不可忽視的。
抗體(ti) 未覆蓋上測試組織：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。