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HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為(wei) H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為(wei) 供氧體(ti) ，H2O2為(wei) 受氫體(ti) 。在ELISA中，DH2一般為(wei) 無色化合物，經酶作用後成為(wei) 有色的產(chan) 物，以便作比色測定。常用的供氫體(ti) 有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS[2,2-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD氧化後的產(chan) 物呈橙紅色，用酸終止酶反應後，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物zui常用的底物。OPD本身難溶於(yu) 水，OPD·2HCL為(wei) 水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與(yu) 過氧化氫混合成底物應用液後更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可製成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為(wei) 方便。過氧化氫則配入底物緩衝(chong) 液中，有製成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的hth体育下载地址中則直接配成含保護劑的工作濃度為(wei) 0.02% H2O2的應用液,隻需加入OPD後即可作為(wei) 底物應用液。