改良過碘酸鈉標記法製備酶標抗體

HRP分子中與(yu) 酶活性無關(guan) 的糖基被過碘酸鈉氧化為(wei) 醛基，再與(yu) 抗體(ti) 蛋白的氨基形成Schiff堿。為(wei) 了防止酶蛋白的氨基與(yu) 醛基發生自身偶聯，在標記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與(yu) 抗體(ti) 的結合反應後，再加入硼氫化鈉還原成穩定的結合物。

（） 取HRP 5mg溶於(yu) 0.2mol/L，pH5.6醋酸鹽緩衝(chong) 液ml中，加入%DNFB無水乙醇溶液0.ml，室溫下輕微攪拌h；
（2） 加入新鮮配置的0.mol/L NaIO4 0.5ml，此時溶液由原棕色變為(wei) 墨綠色，置4℃放置30min，此時溶液由原棕色變為(wei) 墨綠色；
（3） 加入2.5%乙二醇ml， 室溫下輕微攪拌h，終止反應；
（4） 加入待標記的抗體(ti) 5-0mg， 用.0mol/L， pH9.5 CBS，調節pH值至9.0；
（5） 混勻，置4℃過夜改良過碘酸鈉標記法製備酶標抗體(ti)
（6） 加入硼氫化鈉溶液0.ml，混勻，4℃放置3h；
（7） 對0.0mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析過夜，換液3次；
（8） 3000r/min離心30min，去除沉澱物；
（9） 收集上清液即為(wei) 酶標記抗體(ti) 。

【注意事項】
（） 在氧化HRP時，以pH5.6醋酸鹽緩衝(chong) 液溶解酶為(wei) 宜。
（2） 一般認為(wei) 氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為(wei) 宜，不能低於(yu) 0.05mol/L 0.5ml。
（3） 氧化HRP時間以5-30min為(wei) 宜。
（4） 加入DNFB的目的是為(wei) 了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。
（5） 加入乙二醇的目的是終止反應；為(wei) 便於(yu) 在加入抗體(ti) 後調pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配製。
改良過碘酸鈉標記法製備酶標抗體(ti)