單克隆抗體製備過程

、免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chan) 生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先製定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，並分化成為(wei) 致敏B淋巴細胞。

2、細胞融合

采用二氧化碳氣體(ti) 處死小鼠，無菌操作取出脾髒，在平皿內(nei) 擠壓研磨，製備脾細胞懸液。 將準備好的同係骨髓瘤細胞與(yu) 小鼠脾細胞按一定比例混合，並加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與(yu) 骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3、選擇性培養(yang)

選擇性培養(yang) 的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yang) 基。在HAT培養(yang) 基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體(ti) 外存活也逐漸死亡。 隻有融合的雜交瘤細胞由於(yu) 從(cong) 脾細胞獲得了次黃嘌呤--磷酸核糖轉移酶，並具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yang) 基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與(yu) 克隆化

在HAT培養(yang) 基中生長的雜交瘤細胞，隻有少數是分泌預定特異性單克隆抗體(ti) 的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yang) 。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產(chan) 生所需單克隆抗體(ti) 的陽性雜交瘤細胞，並進行克隆擴增。經過全麵鑒定其所分泌單克隆抗體(ti) 的免疫球蛋白類型、亞(ya) 類、特異性、親(qin) 和力、識別抗原的表位及其分子量後，及時進行凍存。

5、單克隆抗體(ti) 的大量製備

單克隆抗體(ti) 的大量製備主要采用動物體(ti) 內(nei) 誘生法和體(ti) 外培養(yang) 法。
()體(ti) 內(nei) 誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體(ti) 石蠟或降植烷進行預處理。-2周後，腹腔內(nei) 接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nei) 增殖，並產(chan) 生和分泌單克隆抗體(ti) 。約-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體(ti) 。
(2)體(ti) 外培養(yang) 法 將雜交瘤細胞置於(yu) 培養(yang) 瓶中進行培養(yang) 。在培養(yang) 過程中，雜交瘤細胞產(chan) 生並分泌單克隆抗體(ti) ，收集培養(yang) 上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體(ti) 。但這種方法產(chan) 生的抗體(ti) 量有限。各種新型培養(yang) 技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體(ti) 的生產(chan) 量。

抗原準備

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抗原，是指能夠刺激機體(ti) 產(chan) 生（特異性）免疫應答，並能與(yu) 免疫應答產(chan) 物抗體(ti) 和致敏淋巴細胞在體(ti) 外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。抗原的基本特性有兩(liang) 種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與(yu) 免疫應答的產(chan) 物發生反應，也就是抗原性。
很多物質都可以成為(wei) 抗原，抗原的具體(ti) 分類可以參見抗原，在進行單克隆抗體(ti) 製備過程中，很多物質都可以成為(wei) 抗原，在常規的科研實驗中，科研者經常選用每隻小鼠/大鼠每次注射0~50ug重組蛋白、偶聯多肽、偶聯小分子等作為(wei) 抗原產(chan) 生特異性的單克隆抗體(ti) 。

動物免疫

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單克隆抗體(ti) 製備的宿主動物一般選用BALB/c小鼠，鼠單抗的應用範圍相當廣泛，一些國內(nei) 外公司均開發出了兔的單克隆抗體(ti) 製備技術。
免疫原分為(wei) 可溶性抗原和顆粒性（細胞）抗原，用無菌鹽水稀釋並與(yu) 佐劑混合，腹腔注射抗原與(yu) 佐劑*混勻後形成的穩定乳狀液，在免疫原提供持續的免疫應答基礎上進行加強免疫
周期第天 采血0.2ml（獲得0.ml免疫前血清）
*次免疫（抗原加弗氏*佐劑）
第4天 第二次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第2天 采血和ELISA檢測
第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第42天 采血和ELISA檢測
第56天 第四次免疫（抗原溶於(yu) PBS或鹽水）
第6天 細胞融合

細胞融合

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（一）融合劑

細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如滅活的仙台病毒，此處例舉(ju) 化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為(wei) 200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體(ti) ，分子量大於(yu) 000時，呈乳白色蠟狀固體(ti) ，能溶於(yu) 水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩定，與(yu) 許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為(wei) 4000者，常用濃度為(wei) 50%，pH8.0～pH8.2（用0%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應zui高。也有采用30%～50%濃度的PEG加上0%二甲亞(ya) 碸。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗後方可應用。要買(mai) 高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。