抗體的活性至關重要

    選擇瘤細胞株的zui重要的一點是與(yu) 待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用zui多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的zui高生長刻度為(wei) 9×05/ml，倍增時間通常為(wei) 0～5h。融合細胞應選擇處於(yu) 對數生、細胞形態和活性佳的細胞（活性應大於(yu) 95％）。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮的培養(yang) 基作適應培養(yang) ，在細胞融合的前一天用新鮮培養(yang) 基調細胞濃度為(wei) 205/ml，次日一般即為(wei) 對數生細胞。
    在體(ti) 外培養(yang) 條件下，細胞的生長依賴適當的細胞密度，因而，在培養(yang) 融合細胞或細胞克隆化培養(yang) 時，還需加入其他飼養(yang) 細胞（feedercell）。常用的飼養(yang) 細胞為(wei) 小鼠的腹腔細胞，製備方法為(wei) 用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數次，吸出後的液體(ti) 中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為(wei) 飼養(yang) 細胞的。
在製備飼養(yang) 細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會(hui) 有嚴(yan) 重汙染。飼養(yang) 細胞調至×05/ml，提前一天或當天置板孔中培養(yang) 。
細胞融合
    細胞融合是雜交瘤技術的中心環節，基本步驟是將兩(liang) 種細胞混合後加入PEG使細胞彼此融合。其後吧培養(yang) 液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合後的細胞適當稀釋，分置培養(yang) 板孔中培養(yang) 。融合過程中有幾個(ge) 問題應特別注意。①細胞比例：骨髓瘤細胞與(yu) 脾細胞的比值可從(cong) :2到:0不等，常用:4的比例。應保證兩(liang) 種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間：在兩(liang) 種細胞的混合細胞懸液中，第min滴加4.5ml培養(yang) 液；間隔2min滴加5ml培養(yang) 液，爾後加培養(yang) 液50ml。③培養(yang) 液的成分：對融合細胞，良好的培養(yang) 液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yang) 成分均需嚴(yan) 格配製。如融合效率降低，應隨時核查培養(yang) 基情況。
有限稀釋法
    篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為(wei) HAT敏感細胞株，所以隻有融合的細胞才能待續存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經有限稀釋後（一般稀釋至0.8個(ge) 細胞/ 孔），按Poisson法計算，應有36％的孔為(wei) 個(ge) 細胞/孔。細胞培養(yang) 至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養(yang) 上清用ELISA檢測抗體(ti) 含量。首先依抗體(ti) 的分泌情況篩選出高抗體(ti) 分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾後進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養(yang) 或凍存。
單克隆抗體(ti) 的製備和凍存
    篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體(ti) 製備，因為(wei) 融合細胞隨培養(yang) 時間延長，發生汙染、染包體(ti) 丟(diu) 失和細胞死亡的機率增加。抗體(ti) 製備有兩(liang) 種方法。一是增量培養(yang) 法，即將雜交瘤細胞在體(ti) 外培養(yang) ，在培養(yang) 液中分離單克隆抗體(ti) 。該法需用特殊的儀(yi) 器設備，一般應用無血清培養(yang) 基，以利於(yu) 單克隆抗體(ti) 的濃縮和純化。zui普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c 小鼠或其親(qin) 代小鼠，先用降植烷或液體(ti) 石蠟行小鼠腹腔注射，一周後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周後即有明顯的腹水產(chan) 生，每隻小鼠可收集 5～0ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法製備的腹水抗體(ti) 含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便於(yu) 抗體(ti) 的純化。接種細胞的數量應適當，一般為(wei) 5×05/鼠，可根據腹水生長情況適當增減。
選出的陽性細胞株應及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存於(yu) 液氮的細胞株活性僅(jin) 有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細胞不同於(yu) 菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞(ya) 碸（DMSO）是普遍應用的凍存保護劑。凍存細胞複蘇後的活性多在50％～95％之間。如果低於(yu) 50％，則說明凍存複蘇過程有問題。
單克隆抗體(ti) 的純化
    單克隆抗體(ti) 的純化方法同多克隆抗體(ti) 的純化，腹水特異性抗體(ti) 的濃度較抗血清中的多克隆抗體(ti) 高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡單的酸沉澱方法。目前zui有效的單克隆抗體(ti) 純化方法為(wei) 親(qin) 和純化法，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗體(ti) 與(yu) 載體(ti) （zui常用Sepharose）交聯，製備親(qin) 和層析柱將抗體(ti) 結合後洗脫，回收率可達90％以上。蛋白可與(yu) IgG、 IgG2a、IgG2b和IgG3結合，同時還結合少量的IgM。洗脫液中的抗體(ti) 濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體(ti) 溶液在A280nm 時，.44（吸光單位）相當於(yu) mg/ml。經低pH洗脫後在收集管內(nei) 預置中和液或速加中和液對保持純化抗體(ti) 的活性至關(guan) 重要。