hth体育下载地址定性測定的顯色與說明書

    .  血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液後，3000轉離心0分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。hth体育下载地址

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鍾取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心0分鍾去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心0分鍾取上清。

5.  保存：如果樣本收集後不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存於(yu) -20℃，避免反複凍融，在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

小鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）操作步驟

  從(cong) 室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘(yu) 板條用自封袋密封放回4℃。
  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
  樣本孔先加待測樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體(ti) 00μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體(ti) ，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5次（也可用洗板機洗板）。
  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。
  每孔加入終止液50μL，5min內(nei) ，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

 繪製標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪製出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。hth体育下载地址

此時酶催化無色的底物生成有色的產(chan) 物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nei) ，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助於(yu) 加速顯色進行。在定量測定中，加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求準確。hth体育下载地址時間一般不需要嚴(yan) 格控製，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37 ℃反應20-30分鍾後即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(hui) 自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產(chan) 物用硫酸終止後，顯色由橙黃色轉向棕黃色。
    TMB受光照的影響不大，hth体育下载地址可在室溫中置於(yu) 操作台上，邊反應觀察結果。但為(wei) 保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後，約40分鍾顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時後即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑製劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（2-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(hui) 使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。
（2）比色
    比色前應先用潔淨的吸水紙拭幹板底附著的液體(ti) ，hth体育下载地址然後將板正確放入酶標比色儀(yi) 的比色架中。以軟板為(wei) 載體(ti) 的試驗，需先將板置於(yu) 標準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪淨，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。hth体育下载地址