紫外（UV）吸收測定法

實驗原理

    蛋白質分子中所含和殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質在280nm波長處有zui大吸收值。在一定濃度範圍內(nei) ，蛋白質溶液的光吸收值（A280）與(yu) 其含量成正比關(guan) 係，可用作定量測定。紫外線吸收法測定蛋白質含量的優(you) 點是迅速，簡便，不消耗樣品，低濃度鹽類不幹擾測定。因此，廣泛應用在柱層析分離中蛋白質洗脫情況的檢測。此法的缺點是：（）對於(yu) 測定那些與(yu) 標準蛋白質中和含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差；（2）若樣品中核酸等吸收紫外線的物質，會(hui) 出現較大的幹擾。不同的蛋白質和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經過校正，測定結果也還存在一定的誤差。但是可作為(wei) 初步定量的依據。該法可測定蛋白範圍應在0.~.0mg /mL。hth体育下载地址

試劑和器材

一、標準和待測蛋白質溶液

.標準蛋白溶液

    結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配製成mg/mL蛋白溶液。

2. 待測蛋白質溶液

    人血清，使用前稀釋00倍。hth体育下载地址

二、器材

    試管.5×5cm（×9），試管架，移液管mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度計。

操作方法

一、製作標準曲線

    取8支試管編號，按下表分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為(wei) cm的石英比色杯，在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為(wei) 縱坐標，蛋白質濃度為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線。

二、樣品測定

    取待測蛋白質溶液mL，加入蒸餾水3mL，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，並從(cong) 標準曲線上查出待測蛋白質的濃度。

注意事項

    由於(yu) 各種蛋白質含有不同量的和苯，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常隻適用於(yu) 測定蛋白質的相對濃度（相對於(yu) 標準蛋白質）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時也會(hui) 影響紫外吸收法測定蛋白質含量的準確性。hth体育下载地址