特異噬菌體抗體的ELISA篩查

.特異噬菌體(ti) 抗體(ti) 的ELISA篩查（單克隆噬菌體(ti) ELISA）將目的蛋白片段包被在免疫吸附板上，經過5輪的擴增-吸附和洗脫。將zui後一輪洗脫得到的噬菌體(ti) 感染TG大腸杆菌，梯度稀釋菌液鋪氨苄抗性瓊脂板，從(cong) 分割較好的克隆中隨機挑選53個(ge) 進行抗原結合的ELISA分析找到候選的克隆。

（）從(cong) 瓊脂板（D3）上接種單一克隆到40μl2×TY-AMP-GLU中，振蕩培養(yang) 37℃（250rpm）過夜。

（2）轉移20μl到第2管的40μl2×TY-AMP-GLU，繼續生長。37℃ 振蕩培養(yang) 直到OD60nm達到0.5。

（3）在第2管中加入8μlM3KO7輔助噬菌體(ti) 。

（4）37℃放30min，然後37℃振蕩h。80g離心0min，抽去上清。

（5）將沉澱重懸於(yu) 40μl2×TY-AMP-KANA，30℃振蕩培養(yang) 過夜。

（6）80g離心0min，使用50μl上清用於(yu) 噬菌體(ti) ELISA（方法見上麵描述）。

（7）包板，每孔0μl抗原。抗原濃度為(wei) 2μg/ml（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被過夜）。

（8）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封閉2h。

（9）用PBS洗一次，加入F6噬菌體(ti) 上清50μl，用4% BSA-PBS補足0μl。

（0）37℃孵育h，棄去測試液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（）加入∶50稀釋的HRP-anti-M3單抗偶聯物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（2）每孔加入0μl顯色液（0μg/mlTMB溶於(yu) 0mmol/L乙酸鈉中，pH6.0，使用前在50ml的該液中加入30%過氧化氫0μl），放置37℃孵育0min，藍色形成。

（3）加入50μlmol/L硫酸終止反應，顏色變黃。

（4）在OD450nm處讀數，減去OD650nm讀數，記錄數據。

2.交叉反應測試（考慮到篩選過程中抗原體(ti) 係中存在BSA，所以測試抗體(ti) 對BSA的交叉反應情況）

（）包板，每孔0μlBSA。抗原濃度為(wei) 2%（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被過夜）。

（2）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封閉2h。

（3）用PBS洗一次，加入F6噬菌體(ti) 上清50μl，用4% BSA-PBS補足0μl。（4）37℃孵育h，棄去測試液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（5）加入∶50稀釋的HRP-anti-M3單抗偶聯物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（6）每孔加入0μl顯色液（0μg/mlTMB溶於(yu) 0mmol/L乙酸鈉中，pH6.0，使用前在50ml的該液中加入30%過氧化氫0μl），放置37℃孵育0min，藍色形成。

（7）加入50μlmol/L硫酸終止反應，顏色變黃。

（8）在OD450nm處讀數，減去OD650nm的讀數，記錄數據。

3.競爭(zheng) 性抑製實驗候選克隆進行競爭(zheng) 性ELISA分析，找到特異的目的克隆。

4.陽性克隆的質粒提取在含有篩選功能的培養(yang) 板（如氨苄抗性或抗性）上挑取單菌落，在含同樣篩選抗性的LB培養(yang) 基中培養(yang) 過夜。然後用普通的質粒提取法提取質粒。抗體(ti)

5.陽性克隆的菌液或質粒送測序