富集培養後的純化分離

    富集培養(yang) 以後的樣品中目的微生物雖然已占了優(you) 勢，但其他微生物仍然存在。因此，為(wei) 了獲得某一特定的微生物菌種，必須對富集培養(yang) 後的樣品進行純化分離。hth体育下载地址

()純種分離的基本方法純種分離通常采用稀釋法和畫線法。畫線法是用接種針挑取微生物樣品在固體(ti) 培養(yang) 基表麵畫線，培養(yang) 後獲得單菌落。畫線法簡便、快速，但所得到的單菌落不一定是純種。稀釋法是先將樣品經無菌水或生理鹽水稀釋後，再塗布到固體(ti) 培養(yang) 基上，培養(yang) 後獲得單菌落。稀釋法使微生物樣品分散更加均勻，獲得純種的概率更大。

(2)通過控製營養(yang) 和培養(yang) 條件進行純種分離

①控製分離培養(yang) 基中的營養(yang) 成分不同微生物對碳源、氮源的需求不一樣。因此需要事先了解被分離微生物的營養(yang) 要求，設計一種合理快速的分離培養(yang) 基，這樣就能夠收到事半功倍的效果。例如以澱粉為(wei) 碳源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生；以纖維素為(wei) 碳源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生纖維素酶；以酪蛋白為(wei) 氮源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生蛋白酶。

②控製培養(yang) 基的pH值不同微生物對pH值的要求不同。細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿(pH7．0～7．5)的生長環境，而黴菌和酵母菌則要求偏酸(pH4．5～6．0)的生長環境。因此．配製分離培養(yang) 基時應調節pH到被分離微生物的要求範圍，這樣既有利於(yu) 所需菌種的生長．也可排除一部分不需要的菌種。例如分離檸檬酸產(chan) 生菌時，調節培養(yang) 基的pH到2．0～2．5，這樣有利於(yu) 分離到產(chan) 生檸檬酸的黑曲黴。又如分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產(chan) 生菌時，可以將培養(yang) 基pH調到9～，能起到濃縮這些菌種的作用。

    培養(yang) 基pH還要考慮其他成分。微生物在生長繁殖過程中，由於(yu) 代謝作用，會(hui) 產(chan) 生酸和堿，使pH會(hui) 發生變化。一般培養(yang) 基C／N高，培養(yang) 後傾(qing) 向於(yu) 酸性，反之則傾(qing) 向於(yu) 堿性。無機鹽的性質也會(hui) 影響pH變化，如(NH 4)2 SO4是生理酸性氮源，NaNO3是生理堿性氮源。為(wei) 了維持培養(yang) 基的pH值，一般要加入磷酸鹽，使培養(yang) 基具緩衝(chong) 能力。如果培養(yang) 基中的酸堿度變化很大，磷酸鹽的緩衝(chong) 容量不足，則可加入適量碳酸鈣，以不斷中和菌體(ti) 代謝過程中產(chan) 生的酸類，使培養(yang) 基的pH保持在恒定的範圍內(nei) 。

③控製培養(yang) 溫度各類微生物的生長溫度不同。根據微生物對生長溫度的需求不同，可將微生物分為(wei) 三類：*類是嗜熱微生物．zui適溫度50～60℃；第二類為(wei) 嗜溫微生物，zui適生長溫度是20～40℃；第三類是嗜冷微生物，zui適溫度為(wei) 5℃以下。因此可控製培養(yang) 溫度以獲得所需要的微生物。

④供氧條件的控製不同微生物對氧的需求不一樣，好氧菌要在有氧條件下培養(yang) ，而厭氧菌則要在厭氧條件下才能生長。hth体育下载地址

    分離厭氧菌．要采取厭氧培養(yang) 法，培養(yang) 過程中要除去氧氣。可在分離培養(yang) 基中加入還原劑．如半、D型、硫化鈉等，快速畫線後，立即置真空密封容器中(充二氧化碳或氮氣)；也可利用焦性沒食子酸和NaOH反應，除去氧氣。

(3)利用平皿的生化反應進行分離(圖2．35) 這是利用特殊的分離培養(yang) 基對微生物進行初步分離的方法。分離培養(yang) 基是根據目的微生物的特殊生理特性或其代謝產(chan) 物的生化反應進行設計的。通過觀察微生物在特殊分離培養(yang) 基上的生長情況或生化反應進行分離，可顯著提高目的微生物分離純化的效率。

①透明圈法在平板培養(yang) 基中加入溶解性較差的底物，使培養(yang) 基混濁。將含目的微生物的待分離樣品接種到此培養(yang) 基中進行培養(yang) ，能分解底物的微生物便會(hui) 在菌落周圍產(chan) 生透明圈，透明圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力。該法多用於(yu) 分離水解酶產(chan) 生菌，如以澱粉為(wei) 碳源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生；以纖維素為(wei) 碳源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生纖維素酶；以酪蛋白為(wei) 氮源的培養(yang) 基可鑒別菌落能否產(chan) 生蛋白酶。根據菌落周圍形成的透明圈的有無和大小，可以大致確定酶活力的有無和強弱。

    產(chan) 有機酸的微生物也可采用透明圈法進行分離。在分離培養(yang) 基中加碳酸鈣，使之形成混濁狀，把土樣懸浮液塗到平板上，如在培養(yang) 過程中產(chan) 酸，則能把菌落四周的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈。

②變色圈法在分離培養(yang) 基中加入指示劑或顯色劑，可使所需微生物能被鑒別出來。如分離產(chan) 生菌時．在培養(yang) 基中加入溴百裏酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色範圍在pH6．2～7．6，當pH6．2以下時為(wei) 黃色，當pH7．6以上時為(wei) 藍色。若平板上出現產(chan) 酸菌，其菌落周圍會(hui) 變成黃色，可挑取黃色菌落，進一步篩選產(chan) 生菌。

    分離降脂微生物的常用方法是把維多利亞(ya) 蘭(lan) 和脂類混合，製成瓊脂培養(yang) 基平板，起始pH調為(wei) 中性，將土樣懸浮液分離在平板上，具有降脂能力的菌落產(chan) 生脂酶，水解脂類底物，使pH由中性下降到酸性，即陽性降脂反應能顯示粉紅色到藍色的變化。若起始pH為(wei)
堿性．則陽性降脂反應從(cong) 咖啡色變成藍綠色，能使脂類底物與(yu) 降脂後的脂肪酸區別開來。

    分離蛋白酶產(chan) 生菌時．除可用酪蛋白作底物，觀察菌落周圍有無透明圈外，還可以吲羥乙酸酯為(wei) 底物，能產(chan) 生堿性蛋白酶的芽胞杆菌菌落，由於(yu) 水解吲羥乙酸酯而產(chan) 生3一羥基吲哚，後者能氧化產(chan) 生藍色產(chan) 物，以此鑒別菌落是否產(chan) 蛋白酶。

③生長圈法生長圈法通常用於(yu) 分離和篩選產(chan) 生氨基酸、核苷酸和維生素的微生物。所用工具菌是一些相對應的營養(yang) 缺陷型菌株。將待分離菌株塗布於(yu) 含高濃度的工具菌並缺少所需營養(yang) 物的平板上進行培養(yang) ，則在能合成該營養(yang) 物的菌落周圍會(hui) 產(chan) 生一個(ge) 混濁的生長圈。

④抑菌圈法抑菌圈法常用於(yu) 分離和篩選產(chan) 生抗生素的微生物。所用工具菌為(wei) 抗生素的敏感菌。若被分離微生物能產(chan) 生某種抗生素．便會(hui) 在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圉。hth体育下载地址

    利用抑菌圈法還能篩選產(chan) 生某些酶類的微生物。如可利用抑菌圈法篩選酰化酶產(chan) 生菌。工具菌為(wei) 一種對苄抗性而對6一氨基青黴烷酸(6一APA)敏感的黏性沙雷氏菌。這種菌隻有當苄青黴索尚未被酰化酶轉化為(wei) 6一APA時才能生長。具體(ti) 做法是將工具菌和苄混合於(yu) 平板培養(yang) 基中，將待分離菌塗布於(yu) 平皿上培養(yang) ．凡菌落周圍出現抑菌圈的即為(wei) 酰化酶產(chan) 生菌。