體外神經組織細胞的培養

    體(ti) 外神經組織細胞的培養(yang) 已成為(wei) 神經生物學研究中十分有用的技術手段。神經細胞培養(yang) 需要*的營養(yang) 條件，對於(yu) 底物的選擇也比其他細胞苛刻。神經細胞在未處理的玻璃或塑料上不能很好地存活，但在膠原蛋白或D一多聚賴氨酸內(nei) 能向外長出軸突。多肽神經因子和神經膠質細胞分泌的因子促進軸突生長。神經組織(nervous tissue)由神經元(neuron)和神經膠質細胞(netaroglia cell)組成。神經元是高度分化的細胞，在體(ti) 外培養(yang) 條件下難以增殖。因此，目前神經元的培養(yang) 主要用於(yu) 原代培養(yang) 。

一、神經元的培養(yang)

(一)材料

．材料來源新生大鼠腦組織。

2．手術器械解剖剪、解剖鑷、眼科剪和眼科鑷。

3．24孔培養(yang) 板和蓋玻片使用前用0．0％PLL處理蓋玻片，室溫過夜。無菌蒸餾水清洗後，紫外線照射滅菌。

4．清洗液HBSS，添加20萬(wan) IU／L和200rng／L。

5．消化液O．05％。

6．培養(yang) 液

()接種培養(yang) 液：DMEM，添加0％HS O．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60mg／L、孕酮、0萬(wan) I U／L和00mg／L。

(2)維持培養(yang) 液：DMEM，添加5％FBS、0％HS 0．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60nng凡孕酮、0mmol／L丙酮酸鈉、5mg／L胰島素、00mg／L轉鐵蛋白、0．％卵白蛋白、0μg／L NGF一β、0萬(wan) I U／L和00mg／L。

(二)方法

．取材采用生後l周以內(nei) 的新生大鼠，頸內(nei) 動脈放血處死後，取腦組織，置於(yu) 無菌平皿內(nei) 。然後，用預冷的HBSS衝(chong) 洗腦組織3次。在解剖顯微鏡下，剝離軟腦膜和血管，取皮質。將皮質腦成mm3左右的小塊。

2．消化將組織塊放人0．05％中，在37℃水浴中振蕩消化30min。用吸管輕輕吹打，然後用不鏽鋼網濾出組織塊。

3．細胞懸液製備用HBSS收集組織塊，將組織塊研碎，用吸管反複吹打，製成細胞懸液。然後，移人5ml離心管中，室溫下靜置0min後棄上清液，重複衝(chong) 洗細胞3次。向離心管內(nei) 細胞沉澱中加入5ml培養(yang) 液，用吸管反複吹打，離心(000r／min，lOmin)。

4．培養(yang) 細胞棄去上清液，用培養(yang) 液懸浮沉澱細胞，將細胞鋪於(yu) 培養(yang) 板中的蓋玻片上，在37℃條件下靜置培養(yang) 。每隔2～3d換液次。

(三)結果觀察

    培養(yang) 24h後，大部分神經元已貼壁生長。神經元胞體(ti) 呈圓形或長杆狀，核大而圓，核仁明顯。可見有細小突起從(cong) 胞體(ti) 長出。3～5d後，細胞突起明顯變長。lOd後，細胞聚集成束，並開始退化。可用微管相關(guan) 蛋白、神經元特異性烯醇化酶和神經絲(si) 等免疫細胞化學方法鑒定神經元，培養(yang) 的細胞中95％以上為(wei) 神經元細胞。

(四)注意事項

    培養(yang) 液中需加入高濃度的葡萄糖，以利於(yu) 神經元的生長。如需維持神經元生長較長時間，可將蓋玻片放在單層神經膠質細胞支持物上進行培養(yang) 。