原生質體融合的影響因素

()原生質體(ti) 融合的影響因素

①融合劑 融合劑有化學融合劑和物理融合劑。

    現在普遍采用的化學融合手段是聚乙二醇(PEG)介導的化學融合法。PEG以分子橋的形式在相鄰原生質體(ti) 膜間起中介作用．改變原生質膜的流動性能，降低原生質膜表麵勢能，使膜中的蛋白顆粒凝集，形成一層易於(yu) 融合的無蛋白質顆粒的磷脂雙分子層。在Ca 2+存在下，引起細胞膜表麵的電子分布的改變，從(cong) 而使接觸處的質膜形成局部融合．出現凹陷，形成原生質體(ti) 橋，成為(wei) 細胞間通道並逐漸擴大，直到兩(liang) 個(ge) 原生質體(ti) 全部融合。PEG的分子量可分為(wei) 幾種，適用的相對分子質量為(wei) 000～6000，不同種類微生物對PEG分子量的要求不同。PEG的用量為(wei) 30％～50％，但隨微生物種類不同而異。

    原生質體(ti) 融合中常用的物理融合劑有電場和激光。電場融合的原理是利用電場的作用使原生質膜穿孔導致原生質體(ti) 融合。電融合過程中電脈衝(chong) 幅度、寬度、波數和個(ge) 數等因素對質膜通透性變化都有較大影響。電融合頻率可比PEG法高十倍以上。激光融合是讓原生質體(ti) 先粘在一起，再用高峰值功率密度激光對接觸處進行照射，使質膜被擊穿或產(chan) 生微米級的微孔。激光融合的優(you) 點是毒性小、損傷(shang) 小、定位強。

②無機離子PEG介導融合需要適量的Ca 2+ 、Mg 2+和一定的pH條件。在電場融合時．混合液中離子的存在對電場及原生質體(ti) 偶極化形成偶極子有一定的影響，會(hui) 幹擾融合．因此，在電融合中一般采用糖或糖醇為(wei) 穩定劑，盡量減少無機離子。

③溫度 溫度對原生質體(ti) 融合頻率有一定的影響，一般在20～30 C下處理～0min。

④親(qin) 株的親(qin) 緣關(guan) 係 雖然原生質體(ti) 融合可以超越性障礙，但進行原生質體(ti) 融合時是選擇親(qin) 緣關(guan) 係比較近的親(qin) 株。因為(wei) 遠緣親(qin) 株融合時染色體(ti) 交換後的重組體(ti) 不穩定，易分離，會(hui) 影響原生質體(ti) 融合的效果。

⑤原生質體(ti) 的活性 原生質體(ti) 的活性對原生質體(ti) 融合有很大的影響，因此要製備高活性的原生質體(ti) 。

⑥細胞密度兩(liang) 個(ge) 親(qin) 株進行原生質體(ti) 融合時，需要一定的細胞密度．一般原生質體(ti) 的濃度要達到07～08個(ge) ／mL，這樣有助於(yu) 提高融合頻率。

(2)融合體(ti) 的再生 融合原生質體(ti) 的再生包括融合體(ti) 細胞壁和融合體(ti) 的再生。細胞壁的重建隻是原生質體(ti) 再生過程中的一步，當完成原生質體(ti) 再生後，進而發育形成菌落，整個(ge) 過程稱為(wei) 複原。複原不僅(jin) 是指原生質體(ti) 本身長出細胞壁，而且還能從(cong) 原生質體(ti) 細胞上長出有細胞壁的菌絲(si) 體(ti) 。原生質體(ti) 的複原是一個(ge) 十分複雜的生物學過程，其中包括細胞本身的調節和修複。

(3)融合體(ti) 檢出和鑒別方法

①直接法原生質體(ti) 融合後直接分離到MM或SM上，即可直接檢出融合細胞。其優(you) 點是隻需一步就可得到重組體(ti) ，且大多數重組體(ti) 是穩定的。缺點是難以檢出那些表型延遲而基因已重組的融合體(ti) 。

②間接法把融合產(chan) 物先分離到CM上，使原生質體(ti) 再生．融合和非融合的原生質體(ti) 都能生長，再分離到SM上。其優(you) 點是能促使細胞壁更好地再生．表型延遲重組體(ti) 容易檢出。缺點是需要兩(liang) 步才能檢出重組體(ti) ，需要相當大人力和物力，而且得到的重組體(ti) 不太穩定。

    直接法和間接法都要用營養(yang) 缺陷型標記，所得重組體(ti) 不一定能提高目標產(chan) 物產(chan) 量。

③鈍化選擇法鈍化選擇法是指滅活原生質體(ti) 和具活性原生質體(ti) 融合。把親(qin) 本中的一方(野生型)原生質體(ti) 在50℃熱處理2～3h，使融合前原生質體(ti) 代謝途徑中的某些酶鈍化而不能再生．再與(yu) 另一方(雙缺陷型)原生質體(ti) 融合，並分離到MM上。滅活除用加熱方法外。還可用紫外線照射或藥物處理。

    總之，原生質體(ti) 融合作為(wei) 發展迅速的一項育種技術，具有*的優(you) 越性，主要表現在以下幾個(ge) 方麵：①原生質體(ti) 融合可以提高重組頻率；②用於(yu) 原生質體(ti) 融合的雙親(qin) 可以少帶標記或不帶標記；③通過雙親(qin) 或多親(qin) 本的原生質體(ti) 融合，使遺傳(chuan) 物質的交換、傳(chuan) 遞更完整，易形成穩定的二倍體(ti) ；④原生質體(ti) 融合沒有嚴(yan) 格的受體(ti) 與(yu) 供體(ti) 之分，是一種超越性障礙的育種方法，受接合型和致育型限製小，有利於(yu) 不同種間、屬間微生物的雜交；⑤利用原生質體(ti) 融合．實現多親(qin) 融合．使各親(qin) 本的整套染色體(ti) 及核外遺傳(chuan) 物質集中到一體(ti) ，有可能增加控製代謝產(chan) 物產(chan) 量的結構基因的拷貝數．從(cong) 而提高目標產(chan) 物產(chan) 量。

    原生質體(ti) 融合與(yu) 誘變相結合，有可能實現增產(chan) 和加速育種進度的目的。如把兩(liang) 親(qin) 株分別進行數次誘變處理，然而進行原生質體(ti) 融合，使相互間遺傳(chuan) 物質進行充分交換，從(cong) 中有可能篩選到由各次誘變累積的能有效提高目標產(chan) 物產(chan) 量的突變基因功能都能充分發揮出來的重組體(ti) 。