溶血空斑形成試驗

    溶血空斑形成試驗(plaque forming cell assay)是體(ti) 外檢測和計數B細胞功能的一種常用方法，即檢測空斑形成細胞(plaque-formiilg cell，PFC)，反映B細胞產(chan) 生抗體(ti) 的功能。當B細胞受抗原或有絲(si) 分裂原刺激後，可分化增殖為(wei) 漿細胞，並分泌抗體(ti) 。B細胞功能減弱或缺陷，可表現為(wei) 抗體(ti) 形成細胞減少及血清Ig量的減少。PFC檢測方法很多，有瓊脂固相法、蓋玻片法、小室液相法、單層細胞法等。

.20%SRBC懸液(用Hank’s液配製)。

2．補體(ti) 取3隻豚鼠的新鮮血清混合，取壓積SRBC，按SRBC與(yu) 豚鼠血清：4～：6的比例加入壓積SRBC，混勻，置4℃冰箱30min，2000r／min離心20min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中可能存在的抗SRBC抗體(ti) ，防止假空斑的出現。

3．底層和頂層瓊脂取抗補體(ti) 作用小的瓊脂，用PBS配成．4％和O．7％兩(liang) 種濃度。

4．DEAE右旋糖酐分子量50萬(wan) ，用蒸餾水配成％濃度備用。

(三)方法

免疫脾細胞懸液的製備

．免疫小鼠：每隻小鼠經尾靜脈或腹腔注入上述SRB(：懸液ml。

2．製備脾細胞懸液：將免疫後第四天的小鼠．拉頸處死，解剖取出脾髒，放人含Ca 2+ 、Mg 2+冷的pH值7．2 PBS中漂洗後，去掉結締組織，加入適量的PBS，用彎頭鑷子擠壓出脾細胞，稍靜置，吸上清液至離心管中，500r／min離心5min，棄上清液後，定量加入PBS，混勻，按白細胞計數法計算脾細胞，zui後用PBS調整細胞數至07／ml的濃度。一般每隻脾髒細胞數為(wei) ～．5×08個(ge) 。

3．傾(qing) 注底層瓊脂將．4％瓊脂凝膠經加熱融化後，傾(qing) 注於(yu) 水平位置的平皿內(nei) ，每皿2～3ml，凝固後，置37℃溫箱，平皿反扣，開蓋lh後備用。

4．頂層瓊脂的製備將0．7％的瓊脂融化後，置於(yu) 45℃恒溫水浴箱中，依次加入：①2×09／ml SRBC懸液O． ml；②％DEAE有旋糖酐0．05ml；③07／ml脾細胞懸液O． ml。迅速混勻後，傾(qing) 注於(yu) 已鋪好底層瓊脂的平皿內(nei) ，使之均勻鋪開，凝固後，靜置約5min，放37℃溫育～．5h。

5．加補體(ti) 從(cong) 溫箱中取出平皿，每皿加入：30稀釋的新鮮豚鼠血清．5ml(如未加DE—AE右旋糖酐，則加原血清或：5稀釋的新鮮血清．5ml)，繼續放37℃溫箱中溫育30min後，取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置lh，4℃冰箱過夜，翌日觀察結果。

(四)結果分析

    肉眼觀察可見空斑為(wei) 邊緣整齊的圓形透明區，如肉眼難以分辨，可在低倍鏡下鑒定，空斑的有淋巴細胞，周圍為(wei) 透明區。一個(ge) 空斑代表一個(ge) PFC，計數每塊玻片的空斑數，算出每個(ge) 脾髒中PFC數。