細胞懸液的製備

(一)實驗方法

．細胞懸液的製備 將生長成單層的細胞，除去培養(yang) 基，HBSS洗滌後，用0．02以EDTA或0．％溶液(無Ca 2+ 、Mg 2+之磷酸緩衝(chong) 液中)37℃消化細胞。冉用HBSS浼滌次，加入適量生長用培養(yang) 基，反複吹吸，製成單細胞懸液，並計數。

2．UDS的放射自顯影顯示法

()將單細胞懸液接種於(yu) 置有小蓋玻片(8mmX 6mm)的培養(yang) 瓶中。37℃培養(yang) ～3d，使細胞在蓋玻片上生長至適當密度。

(2)改換同步化培養(yang) 基(ADM補以％小牛血清)作同步培養(yang) 3－－4d。

(3)在實驗前一日下午，改換含有0mmol／。(HU)的ADM培養(yang) 基，37℃曩續孵育6h。

(4)將上述長有細胞的蓋玻片置於(yu) 含有待檢樣品或已知致癌物的同步用培養(yang) 基(含0mmmol／L HU及5～lOμci／ml，30Ci／mmol 3 H一胸腺嘧啶核苷)中，37℃孵育5h。檢品及已知致癌物溶液在實驗時新鮮配製，以溶劑及已知致癌物為(wei) 對照。

(5)孵育結束後，用HBSS充分洗滌，用％溶液處理0min，隨後用乙醇冰乙酸(3：)固定，4℃過夜。

(6)空氣中幹燥後，用少量中性樹膠，將蓋玻片粘固於(yu) 載玻片上，細胞麵朝上，45℃烘烤24h。

(7)在暗室中，將適量乳膠移入浸漬用玻璃器皿中，置於(yu) 40℃水浴中令其融化，同時取等量蒸餾水於(yu) 量筒中也置於(yu) 該水浴中加熱，待乳膠融化後，將熱蒸餾水傾(qing) 於(yu) 乳膠液中，繼續在水浴中加溫，並用玻璃棒輕輕攪拌，等待lO～20min，使氣泡逸出。在以上準備過程中，將待檢玻片置於(yu) 水浴平台上預熱。準備就緒後，將玻片垂直浸漬於(yu) ：稀釋的乳膠液中約5s，徐徐提出玻片，並用紗布或擦鏡紙拭去玻片背麵乳膠。

(8)將已塗有乳膠的玻片移入溫度為(wei) 29℃及一定濕度的溫箱中(4h)待乳膠幹涸。

(9)將玻片置於(yu) 內(nei) 含適量幹燥劑(變色矽膠)的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光紙及塑料紙，置於(yu) 4℃冰箱中曝光0d。

(0)曝光結束後，將玻片移人有機玻璃製成的玻片架上，在液溫為(wei) 9℃的D一96顯影液中顯影5min，在停顯液中漂洗2min，在F一5定影液中定影6～lOmin，再用水漂洗數小時。

()將玻片脫水透明後，用蓋玻片封固。

(2)在顯微鏡下，每個(ge) 處理組計數各樣本細胞核上的顯影銀粒數，同時計數相當麵積的本底銀粒數，並自核上的銀粒數減去。計數30～50個(ge) 細胞核。

3．LTDS的液體(ti) 閃爍計數顯示法

()將單細胞懸液按0．5×05個(ge) ／ml濃度接種於(yu) 液體(ti) 閃爍計數瓶中，每瓶ml，並加入4C一胸腺嘧啶核苷終濃度為(wei) O．0μci／ml(50mCi／mmol)。37℃於(yu) 細胞增殖培養(yang) 基中培養(yang) 48h使細胞增殖並預標。

(2)去培養(yang) 基並用HBSS洗滌後，換以含4c胸腺嘧啶核苷(O．0μci／m)的同步化培養(yang) 基，37℃進行同步化培養(yang) 2～4d。

(3)實驗前一日下午去培養(yang) 基，用HBSS充分洗滌後，加入含有濃度為(wei) 0mm0／L羥基碌(HU)的同步化培養(yang) 基，37℃孵育6h。

(4)將上述長有細胞的蓋玻片置於(yu) 含有Hu及3 H胸腺嘧啶核苷(5μCi／ml，30Ci／mmol)的同步化培養(yang) 基中，與(yu) 不同濃度的檢品及已知致癌物接觸5h。檢品及已知致癌物溶液在實驗時新鮮配製，以溶劑及已知致癌物為(wei) 對照。

(5)孵育結束後，去培養(yang) 基及檢品。冷鹽水洗滌2次，隨後用冰冷的O．25mol／L過氯酸溶液處理2次，每次2min，以固定細胞並除去酸可溶性成分。

(6)乙醇處理0min除去脂溶性成分及未摻入的標記物，幹後以O．5～lmol／L過氨酸0.5ml，於(yu) 75～80℃恒溫箱中水解40min，使摻人的標記物釋出。

(7)冷卻後加入乙二醇乙醚3．5ml及53ml閃爍液，振搖後使呈勻相，以液體(ti) 閃爍計數器測定各樣本中4c及3 H的放射活性。標本中的3 H放射活性即反映UDS中3 H一胸腺嘧啶核苷的摻人量；而4 c的放射活性反映實驗細胞的數目或其DNA量，因此3 H和4c放射活性比(3 H/4 c)即為(wei) 單位質量DNA或單位數目細胞中UDS水平的反映值。

二、結果判斷

    可用Student氏“t”檢驗檢測各檢品與(yu) 溶劑對照間有無顯著性差異而作出判斷。

    試驗組處理的細胞3 H一胸腺嘧啶核苷摻人數隨待檢樣品劑量增加而增加，且有統計學意義(yi) ，或者zui小劑量組反應陽性，與(yu) 對照組比較具有統計學意義(yi) ，均可判定為(wei) 該試驗陽性。受試物組處理的細胞3H一胸腺嘧啶核苷摻人數不隨待檢樣品劑量增加而增加，任何一個(ge) 劑量組與(yu) 對照組無統計學上的差異，則認為(wei) 受試物在該試驗係統不引起UDS。判定結果時，應綜合考慮生物學意義(yi) 和統計學意義(yi) 。