雞胚原代細胞製備及培養技術

)訓練目的

    了解雞胚的發育過程；掌握雞胚原代細胞製備及培養(yang) 技術。

2)實驗材料

①試劑：Hank’s液、含0％～20％血清的細胞培養(yang) 液、碘酊棉、酒精棉、0．25％。

②器材：超淨工作台或生物安全櫃、細胞培養(yang) 瓶、洗耳球、滅菌吸管、平皿、毛細吸管、離心管、剪刀、小鑷子、CO2培養(yang) 箱、倒置顯微鏡。

3)操作步驟

()雞胚的孵育

受精雞胚放在蛋托上，大頭朝上，放人溫箱培養(yang) 。在溫箱底部放上一盤水，溫度調至37．8℃。

(2)雞胚的發育過程

①觀察方法：將9～2 d的雞胚取出，放人平皿中進行觀察。

②雞胚的發育：采用雞胚進行細胞培養(yang) 時，應對雞胚的發育有一個(ge) 初步了解。雞胚的發育是由受精卵開始的。它在通過輸卵管時，已開始分裂，當產(chan) 卵時已在卵黃上部形成一層細孢，稱為(wei) 胚盤，在適宜的條件下胚盤繼續分裂生長。在發育過程中從(cong) 卵黃和卵白中獲取養(yang) 料和水分．由於(yu) 胚體(ti) 和卵黃分開的緣故，胚胎隻通過卵黃帶與(yu) 卵黃相連。發育的早期形成3個(ge) 胚層，即外胚層、中胚層和內(nei) 胚層，由此形成的胚胎的各個(ge) 器官和組織。一般孵育至3 d出現尿囊，為(wei) 直腸側(ce) 部分的膨出物，尿囊膜是由內(nei) 胚層和中胚層構成的。至第4～5 d胚體(ti) 出現羊膜、尿囊膜及絨毛膜層包被。羊膜係由外胚層和中胚層組成，開始時緊貼於(yu) 胚體(ti) 上，後來腔內(nei) 逐漸充滿羊水。尿囊膜在生長發育的過程中，與(yu) 絨毛膜相連而成絨毛尿囊膜，此膜由三層細胞組成：外層為(wei) 外胚層，內(nei) 層為(wei) 內(nei) 胚層，中間為(wei) 中胚層，其中有很多血管，有兩(liang) 條主動脈自卵黃囊延伸到此膜中，與(yu) 此並行有兩(liang) 條主靜脈，匯成一較大的尿囊靜脈。絨毛尿囊膜是雞胚的呼吸器官，位於(yu) 殼膜之內(nei) 。此膜生長發育很快，第0 d已包圍了整個(ge) 雞胚，此時雞胚已出現羽毛，呼吸道的發育在第2～5 d出現。胚胎體(ti) 積逐漸增大時，胚胎腔外體(ti) 液El趨減少，孵出小雞時已無胚胎腔外體(ti) 液。在發育早期，尿囊液及羊水的成分與(yu) 生理鹽水溶液相差無幾，2 d後羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔積累了腎髒的排泄物，因此，在2 d或3 d後，尿囊液由於(yu) 尿酸鹽的存在，使原來透明的液體(ti) 呈現混濁。尿囊液的酸堿度在7—2 d期間呈弱堿性，在孵育的末期為(wei) pH 6．O。6～3 d雞胚羊水的平均量為(wei) 5—0mL，至3 d有時可達lO mL。卵白的水分在發育的zui初7 d中轉移到卵黃囊內(nei) ，在第6 d卵白轉入羊水腔為(wei) 胚胎所吞食。卵黃在發育時逐漸被一層細胞包圍，自2 d以後卵黃逐漸幹燥，在孵出之後24～48 h，整個(ge) 卵黃囊被吸入小雞腹腔內(nei) ，供雛雞出生後zui初幾天的營養(yang) 。

(3)雞胚原代的細胞培養(yang)

①消毒：選9～2 d的雞胚2—3個(ge) 放入超淨工作台中，大頭(氣室)朝上放置，先用碘酊棉，消毒氣室部位。

②取雞胚：用鑷子剝去頭、四肢及內(nei) 髒，洗2—3次，用Hank's液洗去紅細胞，吸去液體(ti) 。

③剪碎雞胚及清洗：用小剪刀將雞胚反複剪碎成泥狀，加Hank's液，吸入細胞培養(yang) 瓶，稍靜置，讓組織下沉，吸去液體(ti) 。用Hank's液洗2～3次，吸去液體(ti) ，以去除紅細胞等。

④加：根據組織的多少加入一定量的O．25％，的量以將組織塊浸泡在中為(wei) 適中，一個(ge) 雞胚一般加0．25％的4～5 mL。

⑤消化：用膠塞封緊，輕搖均勻，置4℃冰箱靜置過夜或37 ℃水浴消化 h。

⑥洗去：消化完畢後，吸出，用Hank's液或PBS洗3次以洗去，吸去洗液後。洗時注意輕搖，如猛烈搖動，會(hui) 將組織塊搖散，吸去洗液後，用營養(yang) 液將細胞洗出，放入培養(yang) 瓶。

⑦計數培養(yang) ：加入適量的*培養(yang) 液(0～20 mL)，用吸管反複吹打形成細胞懸液，用細胞計數法，計算每mL營養(yang) 液中的細胞數，根據所計算的細胞數，將原液稀釋成06個(ge) ／mL。將稀釋好的細胞懸液接種到培養(yang) 瓶中，一般200 mL培養(yang) 瓶，放5—20 mL培養(yang) 液，節約時可放lO mL培養(yang) 液，培養(yang) 液的量以覆蓋瓶底為(wei) 適中。

⑧放入37℃、5％CO2溫箱培養(yang) ：培養(yang) 時，培養(yang) 瓶的蓋不要擰得太緊，以不會(hui) 下掉為(wei) 度，以便CO2進入。培養(yang) ～2 d後長成單層細胞，即可應用。

4)注意事項

①全部操作過程應在無菌條件下完成。

②故人5％CO2溫箱培養(yang) 的目的是5％CO2能調節培養(yang) 瓶中的pH，使之在一個(ge) 星期或更長時間pH保持不變。