四噻唑藍實驗方法

    四噻唑藍(methylthiazoletetrazolium，MTT)法被廣泛應用於(yu) 細胞增殖和細胞毒性的檢測。MTT為(wei) 黃色化合物，可被活細胞線粒體(ti) 內(nei) 的脫氫酶還原生成不溶於(yu) 水的藍紫色結晶甲臌(formazan)，後者沉積在細胞中，而死亡細胞則無此酶活性而無此過程。在一定細胞敷範圍內(nei) 甲躦結晶的形成量與(yu) 活細胞數成正比。生成的結晶產(chan) 物可被二甲基亞(ya) 碸(DMSO)溶解(也可以用含50％的N，N一二甲基甲酰胺和20％的pH 4．7的十二甲基磺酸鈉的MTT溶解液溶解)，利用酶標儀(yi) 測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。

(一)材料

．待測細胞：96孔培養(yang) 板培養(yang) 24~72h的成層細胞。(按04／200μl／孔接種細胞)。

2．MTT溶液：5mgMTT溶於(yu) lml培養(yang) 液(與(yu) 所用的培養(yang) 細胞液相同，不含酚紅)、

3．0mol／L PBS(pH7．2)或生理鹽水中。0．2μm濾膜除菌後，分裝，4℃保存，兩(liang) 周內(nei) 有效。凍存可保存更長時間。使用時可配成2mg／ml濃度。MTT粉末和溶液均需避光保存。

3．DMSO(分析純)。

4．96孔培養(yang) 板，可調移液器，吸管，離心管。

5．CO2孵箱，顯微鏡，微型振蕩器，酶標儀(yi) 。

(二)方法

．棄去細胞培養(yang) 板中培養(yang) 液。

2．每孔中加入50μl(2 mg／ml)MTT溶液，繼續培養(yang) 3～4h。

3．終止培養(yang) ，小心吸棄(或倒置培養(yang) 板)孔內(nei) 培養(yang) 上清液，如為(wei) 懸浮細胞離心後吸棄上清液。每孔加入50μl DMSO，在微型振蕩器上震蕩5~0min，使結晶充分溶解。

4．比色：選擇490nm波長，在酶標儀(yi) 上測定各孔光吸收值(OD值)，記錄結果。

(三)結果分析

    細胞存活率=實驗組吸光度值÷對照組吸光度值×00％。如果是藥物試驗，以藥物濃度為(wei) 橫坐標，吸光度值為(wei) 縱坐標繪製率曲線。

    繪製生長曲線：以時間為(wei) 橫坐標，吸光值為(wei) 縱坐標繪製細胞的生長曲線。

(四)注意事項

．選擇合適的細胞濃度，培養(yang) 終止時細胞密度不宜過大，這樣才能保證MTT結晶形成的量與(yu) 細胞數呈良好的線性關(guan) 係。

2．避免高濃度的血清物質影響實驗孔的光吸收值，一般選低於(yu) 0％胎牛血清的培養(yang) 液進行實驗。

3．設空白對照。與(yu) 實驗孔平行設不加細胞隻加培養(yang) 液的空白對照孔，其他試驗條件保持一致，比色時，以空白對照孔調零。