傳代培養細胞的方法

方法

()培養(yang) 細胞：取處於(yu) 指數生，用較大平皿培養(yang) 的，80％～90％匯合單層培養(yang) 細胞。

(2)加秋水仙素：使用zui終濃度為(wei) O．02～O．8gg／ml營養(yang) 液；溫箱繼續培養(yang) 6～0h；麥用低溫封閉法：把培養(yang) 細胞置於(yu) 4℃條件下6～2h後，再於(yu) 37℃溫箱中繼續培養(yang) 6～0h處理(加秋水仙素)。

(3)采集分裂細胞：可利用分裂中期細胞體(ti) 變圓與(yu) 底物附著不牢特點，此時手持培養(yang) 瓶，左右反複橫向水平搖動，令培養(yang) 液在培養(yang) 細胞表麵反複衝(chong) 洗，應用此法可使90％的中期分裂細胞從(cong) 瓶壁脫落；注意勿用力過猛，以防多量非分裂細胞脫落影響觀察。

(4)離心：收集培養(yang) 液，000r／min離心5～lOmin。

(5)低滲處理：吸除上清液、加入預溫至37℃的0．075 mol／L KCl溶液，在溫箱中靜置
20～30min．

(6)預固定：向懸液中加新鮮：3醋酸、甲醇固定液lml，用吸管吹打均勻；此措施能起到先使細胞表麵輕微固定，可防止固定後細胞粘連成塊。

(7)固定；離心，同(4)，吸除上清液，加新鮮固定劑5~0ml；加固定劑時要用一手微斜持離心管，另手用吸管吸取固定劑，把固定劑逐滴滴在離心管壁上·使之慢慢流人離心管中，然後輕輕吹打均勻，置5~20min。

(8)重複(7)，末次離心後，小心吸除大部上清液，據懸液中細胞密度大小，餘(yu) 下固定液0．5～ml。

(9)製片：用滴片法製片，按如下步驟：*洗淨載物片，勿留任何油脂，置冰箱中儲(chu) 存備用。滴片前先從(cong) 冰箱中取出冷載物片張，在載物片表麵出現細微水氣時，立即向片的一側(ce) 滴2～3滴細胞懸液(如固定液不散，可能因載物片未洗淨或不冷所致)·滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片後置室溫中令其自然幹燥，或用吹風機熱風吹幹亦可。如此製備好的標本可置盒中備用(做顯帶或熒光觀察等)或立即進行染色觀察。

(0)染色和封片：一般常用Giemsa染色；取幹液Giemsa 份加pH6．8磷酸緩衝(chong) 液9份混合，染色0min後，水洗、晾幹、可直接觀察(使用油浸鏡)；如標本需要保存或做長時間觀察，可過二甲苯兩(liang) 次後，用中性樹膠封片(或先迅速過丙酮兩(liang) 次，每次30s)後，再過二甲苯，然後封片亦可。