血管平滑肌細胞結果分析與鑒定

結果分析與(yu) 鑒定

(一)細胞觀察

．在倒置相差顯微鏡下，當細胞長滿瓶底時，典型的平滑肌細胞為(wei) 梭形，平行呈束狀排列，密集與(yu) 稀疏交叉呈“峰”與(yu) “穀”狀，峰處細胞密集、多層；穀處細胞稀疏甚至沒有細胞。

2．電鏡下觀察，可把平滑肌細胞分為(wei) “合成型”與(yu) “收縮型”兩(liang) 型。前者胞質充滿楹麵內(nei) 質網，但粗肌絲(si) 或細肌絲(si) 很少，肌動蛋白的抗體(ti) 熒光染色為(wei) 陰性，細胞無收縮功能。“收縮型”細胞是平滑肌細胞的典型表現，主要特征為(wei) 胞質內(nei) 有束狀肌絲(si) ，細胞有收縮功能。

3．原代培養(yang) 的zui初周內(nei) 細胞以“收縮型”為(wei) 主，以後逐漸向“合成型”轉化且大量繁殖。傳(chuan) 代培養(yang) zui初從(cong) “收縮型”向“合成型”轉化很快，6～0d後又複原，但已無收譬功能。

(二)MTT比色法

．MTT能進入活的線粒體(ti) 內(nei) ，與(yu) 各種脫氫酶反應，可用於(yu) 測定細胞的成活及增殖。

2．以PBS溶解MTT製成5mg／ml溶液，抽濾滅菌。按每孔00μl培養(yang) 液加入0μl的量把MTT加入細胞培養(yang) 孔內(nei) ，在37℃繼續培養(yang) 4 h。

3．取出培養(yang) 板，吸出孔中培養(yang) 液，每孔加入00μl酸性異丙醇(含0．04 ml／L HCl)，使深藍色結晶*溶解。

4．在室溫下放置數分鍾，確認結晶*溶解後即把培養(yang) 板在570 nm、630 nm處．控l設在．99(如樣品著色過強，則設在．00)的多7L掃描分光光度計下讀數。在加入異丙後l h內(nei) 測定完畢。

5．也可以使用DMSO每孔320μl代替異丙醇溶解細胞內(nei) MTT，在酶聯免疫測定儀(yi) 上司570nm或570 nm、630 nm雙波長處測定吸光值並分析。

(三)3 H-TdR放射免疫測定

．將待測細胞吸去培養(yang) 液，每孔加入含3 H—TdR的培養(yang) 液200μl(含放射量3．7×0 4Bq)，37℃孵育24 h後終止培養(yang) 。

2．以冷PBS200μl清洗3次，加入4℃的0％TCA 200 μl，放於(yu) 4℃冰箱內(nei) 30 min。

3．吸去TCA，加入乙醚一乙醇(：2)混合液200μl漂洗，吸去液體(ti) ，晾幹。

4．加入O．4 mol／L NaOH溶液每孔200μl溶解細胞，在56℃恒溫箱中放置2h。

5．吸出全部液體(ti) ，注入含有5ml閃爍液的閃爍瓶中，加蓋搖勻，放置2h後進行液閃測定。