小鼠Treg檢測操作步驟

、在每個(ge) 流式上樣管中加入00 μl準備好的細胞懸液，細胞數約為(wei) x06個(ge) .

2、按照細胞表麵抗原染色方法標記表麵抗原。根據說明書(shu) 加入CD4和CD25抗體(ti) 00 μl體(ti) 係中使用0.25 μg FITC anti-mouse CD4，0.06 μg APC anti-mouse CD25抗體(ti) 。根據這些試劑詳細的說明書(shu) 操作。4 ℃孵育30 分鍾。孵育表麵抗體(ti) 之前加入Fc受體(ti) 阻斷劑。 

3、用預冷流式染色緩衝(chong) 溶液洗滌細胞（離心並轉移）。

4、旋渦震蕩重懸細胞後加入ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（:3稀釋好），並再次旋渦混勻。

5、避光4℃孵育30分鍾到8小時（孵育30分鍾到8小時，結果一樣）。

6、加入2ml 破膜緩衝(chong) 液（Permeabilization Buffer）（:9去離子水稀釋）離心洗滌細胞並棄去上清液。

7、重複第6步操作洗滌細胞。

8、（可選）加入含0.5 μg Fc受體(ti) 阻斷劑的破膜緩衝(chong) 液，保證00 μl體(ti) 係4 ℃孵育5分鍾。

9、封閉液無需洗去，體(ti) 係加入0.5 μg PE anti-mouse/rat Foxp3抗體(ti) 和PE Rat lgG2a同型對照（用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋），避光4℃孵育至少30分鍾。建議進行預實驗摸索出抗體(ti) 的zui適濃度。

0、加入2ml破膜工作液離心洗滌細胞並棄去上清液。

、重複上一步洗滌細胞。

    用適量體(ti) 積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，並上機檢測並分析。注：由於(yu) 染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態上會(hui) 有一定變化。