PCR操作時應注意的事項

    PCR檢測微量感染因子時，容易因為(wei) 汙染的而導致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應該嚴(yan) 格遵守一些操作規程，zui大程度地降低可能出現的PCR汙染或杜絕汙染的出現。hth体育下载地址

（）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現*閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個(ge) 不同的區域內(nei) 進行，PCR的前處理和後處理要在不同的隔離區內(nei) 進行：

① 標本處理區，包括擴增摸板的製備；

② PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；

③ 產(chan) 物分析區，凝膠電泳分析，產(chan) 物拍照及重組克隆的製備。

    各工作區要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標本製備→PCR擴增→產(chan) 物分析→產(chan) 物處理。

切記：產(chan) 物分析區的產(chan) 物及器材不要拿到其他兩(liang) 個(ge) 工作區。

（2）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超淨工作台或負壓工作台配製和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放於(yu) 其中，不能用來吸取擴增後的DNA和其他來源的DNA：

① PCR用水應為(wei) 高壓的雙蒸水；

② 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chan) 物區配製；hth体育下载地址

③ 引物和dNTP應分裝儲(chu) 存，分裝時應標明時間，以備發生汙染時查找原因。

（3） 實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅(jin) 要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應

該注意：

① 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

② 使用一次性吸頭，嚴(yan) 禁與(yu) PCR產(chan) 物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於(yu) 空氣中，避免氣溶膠的汙染；

③ 避免反應液飛濺，打開反應管時為(wei) 避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體(ti) 於(yu) 管底。若不小心濺到手套或桌麵上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌麵；

④ 操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dNTP、緩衝(chong) 液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的度；

⑤ zui後加入反應模板，加入後蓋緊反應管；

⑥ 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增係統的可信性；

⑦ 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於(yu) 加樣器zui容易受產(chan) 物氣溶膠或標本DNA的汙染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該，不能交叉使用，尤其是PCR產(chan) 物分析所用加樣器不能拿到其它兩(liang) 個(ge) 區；

⑧ 重複實驗，驗證結果，慎下結論。hth体育下载地址